雷公藤內酯醇抑制COX-2表達調控胰腺癌細胞生物學性狀的實驗研究

孫運良 馬建霞 吳紅玉 金晶 李淑德

·短篇論著·

雷公藤內酯醇抑制COX-2表達調控胰腺癌細胞生物學性狀的實驗研究

孫運良 馬建霞 吳紅玉 金晶 李淑德

雷公藤內酯醇(triptolide，TPL)是從中國傳統中藥雷公藤中提取的有效成分。近年來的研究發現，TPL不僅具有抗炎、抗免疫反應等多種藥理作用，還具有廣譜抗腫瘤作用，是一種多靶點的天然抗腫瘤藥物[1-4]。實驗表明，TPL能抑制體外培養的胰腺癌細胞增殖及胰腺癌動物移植瘤的生長[1]。環氧化酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)為一種誘導型酶，與多種腫瘤的發生、發展密切相關[5]。研究發現，TPL不僅可通過抑制COX-2表達調控炎癥過程，還可通過下調COX-2表達抑制結腸癌細胞的增殖和遷移[2,6]。然而TPL是否也通過下調胰腺癌細胞COX-2的表達而抑制腫瘤生長目前尚不清楚。本研究應用TPL干預人胰腺癌PANC1細胞，觀察其對細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的作用，探討其相關機制。

一、材料和方法

1．細胞增殖檢測：人胰腺癌細胞株PANC1為長海醫院保存，常規培養、傳代。收集對數生長期細胞，調整細胞密度為5×105/ml。96孔板每孔加入100 μl細胞懸液培養過夜，待細胞貼壁后更換為無血清的DMEM培養液，并分別加入終濃度為20、40、80 ng/ml的TPL(Sigma公司，純度≥98.0%)繼續培養24、48 h。以不加TPL干預的細胞作為陰性對照，以PBS作為空白對照。每個濃度設6個復孔。培養到時間點后每孔加入20 μl MTT溶液(5 mg/ml)繼續培養4 h，吸去孔內培養液，加入150 μl DMSO，低速振蕩10 min，上酶聯免疫檢測儀測各孔在波長570 nm處的吸光值(A570值)。細胞增殖率=(實驗孔A570值/空白對照孔A570值)×100%。

2．細胞凋亡檢測：取對數生長期細胞，以1×105/孔接種于24孔板，培養至細胞貼壁后更換培養液，分別加入終濃度為20、40、80 ng/ml TPL繼續培養24 h，以不加TPL干預的細胞作為陰性對照。收集細胞，上流式細胞儀檢測細胞的凋亡。Annexin V-FITC試劑盒購自晶美生物工程有限公司，按說明書操作。

3．細胞的遷移能力檢測：取對數生長期細胞，以5×105/孔接種于6孔板，培養至約90%融合狀態時棄去培養液，用10 μl的Eppendorf Tip在平板中間劃一條橫線，PBS沖洗3次，加入無血清的DMEM培養液。然后分別加入終濃度為20、40、80 ng/ml的TPL繼續培養24 h，以不加TPL干預的細胞作為陰性對照。按0、24 h取樣，測量劃痕的距離。細胞遷移率=[(0 h劃痕距離-24 h劃痕距離)/0 h劃痕距離]×%。

4．細胞侵襲能力檢測：Transwell小室購自Coster公司。每個小室的聚碳酸酯膜上加50 μl用無血清DMEM培養液稀釋的Matrigel，待其充分聚合。Transwell下室加入600 μl含10% FBS的DMEM培養液，Transwell上室加入200 μl用無血清DMEM培養液制備的5×105/ml的細胞懸液，分別加入終濃度為20、40、80 ng/ml的TPL培養24 h，以不加TPL干預的細胞作為陰性對照。培養24 h 后取出Transwell小室，用棉簽拭去聚碳酸酯膜表面的Matrigel，PBS輕輕沖洗，晾干，然后用0.1%結晶紫染色膜10 min，去除多余結晶紫染液，普通光學顯微鏡下觀察。每個干預濃度做3個小室。每個樣本隨機選取5個200倍視野，計數穿膜細胞數，取均值表示腫瘤細胞的侵襲能力。

5．細胞COX-2、Caspase-3、MMP-9蛋白表達檢測：取各組不同濃度TPL干預24 h的PANC1細胞，用RIPA裂解液制備細胞總蛋白，測定蛋白濃度，常規行蛋白質印跡法檢測COX-2、Caspase-3、MMP-9蛋白表達。以β-actin為內參。兔抗人COX-2、Caspase-3抗體，山羊抗人MMP-9抗體均購自Santa Cruz公司。最后ECL顯影、膠片曝光、顯影、定影。用凝膠圖像軟件分析系統掃描膠片，以目的條帶與內參條帶的灰度值比表示蛋白的相對表達量。

二、結果

1．PANC1細胞增殖的變化：TPL呈時間及濃度依賴性抑制PANC1細胞的增殖(圖1)。

2．PANC1細胞凋亡的變化：陰性對照組及20、40、80 ng/ml TPL干預組的細胞凋亡率分別為(2.6±0.5)%、(4.7±1.0)%、(10.5±2.0)%、(21.1±4.2)%(圖2)。各干預組PANC1細胞的凋亡率均顯著高于陰性對照組，差異均具有統計學意義(P值均<0.05)。

3．PANC1細胞遷移力的變化：陰性對照組及20、40、80 ng/ml TPL干預組細胞遷移率分別為(79.3±8.2)%、(73.3±7.0)%、(51.0±6.2)%、(32.3±4.5)%(圖3)。40、80 ng/ml組均顯著低于陰性對照組，差異有統計學意義(P值均<0.01)，而20 ng/ml組與陰性對照組的差異無統計學意義(P>0.05)。

與陰性對照組比較，aP<0.05；與24 h組比較，bP<0.05

圖2 對照組(2A)及20、40、80 ng/ml TPL干預組(2B、2C、2D)PANC1凋亡細胞

4．PANC1細胞的侵襲力變化：陰性對照組及20、40、80 ng/ml TPL干預組的穿膜細胞數分別為(23.2±4.0)、(46.0±6.2)、(37.2±5.6)、(31.5±4.8)個/200倍視野。各干預組穿膜細胞數均顯著高于陰性對照組，差異具有統計學意義(P值均<0.05)，但隨TPL濃度的增加穿膜細胞數減少(圖4)。

5．PANC1細胞COX-2、Caspase-3、MMP-9蛋白表達量的變化：隨著TPL濃度的增加， PANC1細胞COX-2、MMP-9蛋白表達量逐漸下降，而Caspase-3蛋白表達量逐漸增加(圖5)。

圖3 PANC1細胞的遷移能力(劃痕實驗 ×100)

圖4 對照組(4A)及20、40、80 ng/ml TPL干預組(4B、4C、4D)PANC1細胞的侵襲能力(Transwell小室 ×200)

圖5 對照組(1)及20、40、80 ng/ml TPL干預組(2、3、4)PANC1細胞COX-2、Caspase-3和MMP-9蛋白的表達

討論盡管已有大量的實驗證明TPL具有抗腫瘤作用，但其確切機制尚有待于進一步明確。COX-2作為一種誘導酶，生理狀態下在大多數組織中不表達或微量表達，但在炎癥等病理過程中表達增加。研究證實，COX-2在胰腺癌組織中高表達[7]，使用選擇性COX-2抑制劑或沉默COX-2基因后均能抑制胰腺癌細胞生長，并誘導細胞凋亡，提示COX-2在胰腺癌的發生、發展過程中有著重要的作用[8-9]。本研究結果顯示，TPL抑制胰腺癌細胞增殖、促進胰腺癌細胞凋亡，同時明顯抑制COX-2蛋白表達，表明COX-2是TPL抗胰腺癌的分子靶點之一。Johnson等[2]的研究也發現，TPL可通過抑制結腸癌COX-2的表達，進而抑制腫瘤細胞增殖、促進腫瘤細胞凋亡。

Caspase-3是Caspase家族中最重要的凋亡執行者之一，是細胞凋亡過程中的主要效應因子。研究顯示，Caspase-3是COX-2重要的下游分子；特異性COX-2抑制劑NS-398或塞來昔布均可上調Caspase-3表達，促進腫瘤細胞凋亡，從而抑制腫瘤細胞生長[10-11]。本研究結果顯示，TPL呈濃度依賴性抑制胰腺癌細胞增殖、誘導細胞凋亡，且呈劑量依賴性抑制COX-2、促進Caspase-3表達，提示TPL通過抑制COX-2表達，促進Caspase-3表達，從而發揮抑制胰腺癌細胞增殖、誘導細胞凋亡的作用。

侵襲、遷移是胰腺癌的主要生物學行為，也是影響治療效果和預后的重要因素。Zhang等[12]的研究及本課題組前期研究[13]的結果表明，MMP-9在胰腺癌細胞中呈高表達，其過度表達與腫瘤對周圍組織的侵襲及遠處轉移密切相關。近年的研究發現，COX-2可誘導MMP-9的產生，特異性COX-2抑制劑下調MMP-9蛋白表達，表明MMP-9是COX-2促進腫瘤侵襲和遷移的下游基因之一[14-15]。本研究結果顯示，TPL亦下調胰腺癌細胞MMP-9表達，抑制胰腺癌細胞的遷移和侵襲。

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(本文編輯：呂芳萍)

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2015.03.017

江蘇省衛生廳科研項目(Y201420)；連云港市衛生局科研項目(1242)

222100 連云港 ，江蘇省連云港市贛榆區人民醫院消化內科(孫運良)；上海復旦大學附屬華東醫院消化內科(馬建霞)；第二軍醫大學附屬長海醫院消化內科(吳紅玉、金晶、李淑德)

李淑德，Email：lishude57@126.com

2014-01-12)