熒光光譜法研究納米TiO2與肌紅蛋白的相互作用

黃鶴勇, 周家宏, 馮玉英

(1. 南京師范大學 分析測試中心， 江蘇 南京 210023； 2. 南京師范大學 地理科學學院， 江蘇 南京 210023)

熒光光譜法研究納米TiO2與肌紅蛋白的相互作用

黃鶴勇1,2, 周家宏1, 馮玉英1

(1. 南京師范大學 分析測試中心， 江蘇 南京 210023； 2. 南京師范大學 地理科學學院， 江蘇 南京 210023)

采用溶膠-凝膠法合成TiO2納米顆粒，通過TEM對納米TiO2進行了表征。結果表明，納米TiO2的粒徑約為5～6 nm。利用熒光光譜法研究了納米TiO2與肌紅蛋白(Mb)的相互作用，研究表明這種相互作用能使肌紅蛋白的內源熒光猝滅。通過猝滅常數、結合常數和結合位點數的計算，證明此猝滅為靜態猝滅機制，結合位點數約為1。根據熱力學參數確定了它們之間的作用力主要是靜電力和疏水力，使肌紅蛋白構象發生了變化。

納米TiO2； 肌紅蛋白； 熒光光譜； 相互作用

自從1985年日本學者Mstsunaga等[1]首次報道光激發TiO2有殺菌效果以來，TiO2光催化氧化在生物領域的應用研究引起了化學家、化學工程師和微生物家的極大關注，并很快成為人們研究的熱點[2]。近年來，國內外有關TiO2光催化氧化法殺菌研究報道較多[3-8]，也有應用于人體內癌細胞殺傷作用的報道[9]。不過對TiO2與蛋白質作用的研究很少。本文研究納米TiO2粒子與馬心肌紅蛋白(Mb)的結合作用。

由于固體表面-蛋白質吸附的體系比較復雜，本文采用最“簡單”的體系。納米TiO2采用溶膠-凝膠法制備，在緩沖體系中與Mb作用，通過熒光光譜研究納米TiO2粒子對馬心肌紅蛋白(Mb)的猝滅作用，根據其猝滅曲線得出納米TiO2粒子與肌紅蛋白的猝滅常數以及它們的結合常數，并結合熱力學參數確定了它們之間的作用力類型；同時用同步熒光光譜研究了納米TiO2粒子濃度對Mb 的構象變化的影響。

1 實驗

1.1 儀器與試劑

肌紅蛋白為美國Sigma公司產品，使用前未經進一步的提純，用二次去離子水配制0.04 mol/L混合磷酸鹽溶液(pH=7.4)作緩沖液，肌紅蛋白的濃度為5.26×10-6mol/L。其他試劑均為分析純試劑。熒光光譜采用Perkin-Elmer公司的LS-50B型熒光光譜儀。透射電鏡采用采用JEM-200CX 型透射電鏡表征納米TiO2的形態和晶粒大小，掃描加速電壓為 160 kV。

1.2 納米TiO2粒子的制備

量取4 mL鈦酸四丁酯并溶解在20 mL的無水乙醇中，再加入適量冰醋酸，作為A液。量取20 mL的無水乙醇，再加入10 mL一定質量分數的鹽酸(pH = 2左右)，作為B溶液。在磁力攪拌條件下將B液慢慢滴加到A中，滴加完畢繼續攪拌5 h，即得到穩定透明的納米TiO2溶膠。制得的納米TiO2溶液用二甲基亞砜(DMSO)配制，濃度為1.0×10-3mol/L。

1.3 熒光光譜圖的繪制

光譜測定：移取2.5mL蛋白質溶液于1cm的石英比色皿中，用微量注射器逐次加入10μL 的納米TiO2溶液并混合均勻，LS 50 B型熒光光譜儀進行熒光測定。熒光發射與激發狹縫寬度均為10 nm，掃描速度500 nm/min,取波長差分別為20、80 nm，掃描得到同步熒光光譜。

2 結果與討論

2.1 納米TiO2的透射電鏡圖

納米TiO2的透射電鏡圖如圖1所示。由圖可見，溶膠-凝膠法所制備的納米TiO2為球形顆粒，其粒徑約為5～6 nm。

圖1 納米TiO2的透射電鏡圖

2.2 TiO2對Mb的熒光猝滅光譜

蛋白質中由于色氨酸、酪氨酸的存在使其具有內源熒光。固定Mb的濃度([Mb]=5.26 μmol/L)，逐漸加入TiO2，以280 nm為激發波長(發射波長為330 nm)，掃描體系的熒光光譜見圖2，圖中[TiO2]=0,0.8,1.6,2.4,3.2,4.0,4.8 μmol/L。由圖2可見，隨著TiO2濃度升高，Mb的內源熒光強度有規律地降低，說明納米TiO2對Mb的熒光有猝滅作用，它們之間存在相互作用。

圖2 納米TiO2與Mb相互作用的熒光發射光譜

2.3 熒光猝滅作用的Stern-Volmer分析

引起Mb熒光猝滅的原因可能有動態猝滅和(或)靜態猝滅。動態猝滅是猝滅劑和熒光物質的激發態分子之間的相互作用過程，是與自發的發射過程相競爭從而縮短激發態壽命的過程，不影響蛋白質的結構和生理活性。靜態猝滅則是由于發生了配合作用,通常是產生了不發熒光的配合物,對蛋白質的二級結構可產生影響，并可影響其生理活性。

碰撞猝滅過程遵循Stem-Volmer[10]方程;

(1)

式中，F0是猝滅劑不存在時的熒光強度，F為加入猝滅劑后的熒光強度，Ksv為動態猝滅常數，[Q]為猝滅劑濃度，Kq為雙分子猝滅過程速率常數，τ0為猝滅劑不存在時熒光分子的平均壽命。

假定此過程為動態猝滅過程，根據式(1)，以熒光分子的熒光強度變化F0/F對猝滅劑濃度[TiO2]作圖(見圖3)，直線斜率代表熒光猝滅過程速率常數Ksv。從圖3可以看出，隨溫度升高直線斜率減小，表明此猝滅過程不應為動態猝滅，而應為生成納米TiO2-Mb復合物的靜態猝滅。

圖3 納米TiO2與Mb作用的Stern-Volmer曲線

一般生物大分子的熒光壽命為10-8s[11]，由猝滅曲線斜率可求出猝滅過程速率常數(t=26 ℃，Kq=3.79×1011L/(mol·s)，相關系數R=0.988 9；t=45 ℃，Kq=2.96×1011L/(mol·s)，R=0.988 4)。但是，各類猝滅劑對生物大分子的最大擴散碰撞猝滅速率常數為2×1010L/(mol·s)[12]，很明顯這里猝滅速率常數大于擴散控制的猝滅常數，說明上述猝滅速率過程不是由于納米TiO2粒子對Mb動態碰撞引起的動態猝滅，而是由于納米TiO2與Mb形成了復合物引起的靜態猝滅。

2.4 結合位點數和結合常數

對于靜態猝滅，有：

(2)

由圖2統一讀取280/330 nm處的熒光強度，按(2)式進行數據處理，得到圖4，由斜率(26 ℃，n=0.996，R=0.987 3；45 ℃，n=1.21，R=0.987 0)知結合數n≈1，說明在水溶液中每一個Mb分子與一個納米TiO2粒子結合形成復合物。

圖4 lg[(F0-F)/F]對lg[TiO2]的線性擬合曲線

利用靜態猝滅雙倒數[7]公式

(3)

作Lineweaver-Burk曲線，見圖5。由直線斜率求得納米TiO2與Mb在不同溫度下的離解常數KD，從而進一步求得結合常數KA=1/KD。得到26 ℃和45 ℃下的KA分別為3.67×103L/mol和2.02×103L/mol;相關系數R分別為0.993 5和0.993 7。

圖5 納米TiO2對Mb熒光猝滅的Lineweaver-Burk曲線

可見，納米TiO2與Mb之間的結合常數較大，說明兩者之間有較強的結合力。

2.5 結合的熱力學參數及作用力

由此可見，△H<0，△S>0，兩者之間的作用力應為靜電力。Ross等[14]認為，很多情況下，即使△H<0，蛋白質和一些小分子之間主要作用力仍為疏水作用力。因此，可以認為納米TiO2與Mb之間作用力為疏水力和靜電力。

2.6 同步熒光法研究CF對Mb構象的影響

圖6為Mb([Mb]=5.26 μmol/L)與不同濃度([TiO2]=0,0.8,1.6,2.4,3.2,4.0,4.8 μmol/L)的納米TiO2作用后，步長△λ為20 nm和80 nm的同步熒光光譜。由圖6可見，在Mb溶液中沒有納米TiO2的同步熒光光譜，△λ=20 nm時的Mb的熒光發射峰位于309 nm處(圖6(a)，曲線0)，這是Mb中酪氨酸殘基的發射峰。△λ=80 nm時的Mb的熒光發射峰均位于350 nm處(圖6(b)，曲線0)，這是Mb色氨酸殘基的發射峰。因為蛋白質中色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸是僅有的發熒光的氨基酸殘基，其中苯丙氨酸通常以共振能的形式把自己的激發能轉移到色氨酸殘基上，所以在蛋白質中通常觀察不到苯丙氨酸的熒光發射峰，只能觀察到色氨酸和酪氨酸殘基的熒光光譜[9]。而且當△λ=20 nm時，蛋白質的熒光光譜表現為酪氨酸殘基的熒光發射峰，而當△λ=80 nm時，為蛋白質中色氨酸殘基的熒光發射峰[15]。

圖6 Mb的同步熒光光譜

當在Mb溶液中加入納米TiO2后，酪氨酸和色氨酸殘基的發射峰均發生紅移，峰強度也有明顯的降低。當溶液中加入4.8 μmol/L納米TiO2后，酪氨酸殘基的熒光發射峰位于318 nm，紅移9 nm，強度下降61%；色氨酸殘基的發射峰位于353 nm處，紅移3 nm，強度下降56%。峰位紅移和峰強下降表明納米TiO2與Mb作用后，使Mb分子的構象發生了變化，以致其氨基酸殘基所處的微環境也發生了變化。

根據Stern-Volmer方程：F0/F=1+Ks[Q]，通過對熒光數據進行處理，還可以得到納米TiO2猝滅Mb分子中的酪氨酸和色氨酸殘基的動力學參數。納米TiO2對Mb分子中酪氨酸和色氨酸殘基的熒光平均猝滅常數分別為Ks=3.87×103L/mol和Ks=3.20×103L/mol。

3 結論

實驗結果表明,納米TiO2與Mb之間有很強的結合作用，它們之間的作用力主要是靜電力和疏水力，使Mb構象發生了變化。其猝滅過程速率常數為：26 ℃時Kq=3.79×1011L/(mol·s)，R=0.988 9；45 ℃時Kq=2.96×1011L/(mol·s)，R=0.988 4；其結合常數：26 ℃時有KA=3.67×103L/mol，R=0.993 5；45 ℃時有KA=2.02×103L/mol，R=0.993 7。其結合位點數約等于1。

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Study on interaction of myoglobin with TiO2nanoparticlesby fluorescence spectroscopy

Huang Heyong1，2, Zhou Jiahong1, Feng Yuying1

(1. Analysis and Testing Center, Nanjing Normal University, Nanjing 210023, China;2. School of Geography Science, Nanjing Normal University, Nanjing 210023, China)

TiO2nanoparticles is synthesized by using the Sol-gel method.The morphology of TiO2nanoparticles are characterized by the transmission electron microscopy(TEM).The interaction between TiO2and myoglobin (Mb) is studied by using the fluorescence spectroscopic method.TiO2effectively quenches the intrinsic fluorescence of Mb via static quenching.The process of binding TiO2on Mb is a spontaneous molecular interaction procedure. According to thermodynamic parameters,ΔHand ΔS, it is indicated that the hydrophobic and electrostatic interactions can play a major role in stabilizing the TiO2-Mb complex.

TiO2nanoparticles; myoglobin; fluorescence spectroscopy; interaction

2014- 09- 10 修改日期：2014- 11- 26

國家自然科學基金項目(20603018);江蘇省科技發展計劃(BM2007132)資助項目

黃鶴勇(1986—)，男，江蘇南通，碩士，實驗師，研究方向為光譜和色譜.

E-mail：huangheyong@njnu.edu.cn

TB383

A

1002-4956(2015)5- 0071- 04