綠茶多糖的乙酰化修飾及其清除自由基、活性的研究

梁少茹,肖 霄,肖 斌,*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝學(xué)院 ,陜西楊陵 712100;2.北京林業(yè)大學(xué)林木生物質(zhì)化學(xué)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 ,北京 100083)

梁少茹1,肖 霄2,肖 斌1,*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝學(xué)院 ,陜西楊陵 712100;2.北京林業(yè)大學(xué)林木生物質(zhì)化學(xué)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 ,北京 100083)

綠茶多糖,乙酰化,自由基,亞硝基,清除活性

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

綠茶 來自西北農(nóng)林科技大學(xué)茶葉實(shí)驗(yàn)站;無水乙醇、95%乙醇、氯仿、正丁醇、乙醚、丙酮、氫氧化鈉、過氧化氫、乙酸酐、鄰二氮菲、鄰苯三酚、無水對(duì)氨基苯磺酸、鹽酸萘乙二胺、硫酸亞鐵、亞硝酸鈉、鹽酸羥胺、檸檬酸、檸檬酸鈉、磷酸二氫鉀、醋酸鈉等試劑均為國產(chǎn)分析純。

AL-204分析天平電子天平 梅特勒-托利多(上海)儀器有限公司;UV3802準(zhǔn)雙光束紫外可見分光光度計(jì) 上海尤尼柯儀器有限公司;SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵 鄭州長城科工貿(mào)有限公司;RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠;DK-S26型電熱恒溫水浴鍋 上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;TGL-18M高速冷凍離心機(jī) 上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 綠茶多糖的提取與純化 綠茶多糖的提取與純化方法[10-11]如下:綠茶茶葉粉碎,過30目篩,按茶水比1∶20在55℃下水浸提2.5h,趁熱過濾,55℃溫度條件下減壓濃縮至原體積的三分之一,加入3倍體積95%乙醇沉淀,沉淀物用丙酮、無水乙醇、乙醚交替洗滌3次,經(jīng)Sevag 法脫蛋白、過氧化氫脫色,再經(jīng)透析后凍干即為純化茶多糖(TPS)。

1.2.2 茶多糖的乙酰化修飾及最佳修飾條件確定 茶多糖乙酰化修飾方法[8]如下:取綠茶多糖樣品0.5g加入到10mL蒸餾水中并混勻,用0.5mol/L氫氧化鈉調(diào)pH為9.0,一定溫度(20～40℃)保溫,其間交替向溶液中加入一定量的乙酸酐和0.5mol/L的氫氧化鈉以保持溶液pH為8.0。反應(yīng)期間溫度控制在20～40℃,乙酸酐加入量為10～20mL,保溫時(shí)間為3～5h。反應(yīng)結(jié)束后,用5mol/L鹽酸調(diào)整溶液的pH為7.0,冷卻后將混合液置于透析袋中流水透析3d,再經(jīng)減壓濃縮、醇沉、冷凍干燥后即得乙酰化茶多糖(Acetylated tea polysaccharides,A-TPS)。乙酰化多糖的取代度采用堿性羥胺比色法[12]進(jìn)行測(cè)定,先繪制乙酰基濃度與其吸光度(A=540nm)的標(biāo)準(zhǔn)曲線,測(cè)出樣品中乙酰基含量,然后計(jì)算取代度。取代度計(jì)算公式:

式中,W為茶多糖中乙酰基含量。

通過分析比較,保溫時(shí)間(A)、茶多糖與乙酸酐的體積比(B)、反應(yīng)溫度(C)是影響反應(yīng)進(jìn)程的主要因素[13],以取代度為指標(biāo),通過單因素實(shí)驗(yàn)對(duì)各因素進(jìn)行考察,得出各因素水平取值。選擇這3個(gè)指標(biāo)作為實(shí)驗(yàn)三因素,設(shè)計(jì)三因素三水平的正交實(shí)驗(yàn),參照上述乙酰化茶多糖修飾方法,按L9(34)正交表進(jìn)行實(shí)驗(yàn),研究得到最高取代度乙酰化茶多糖的反應(yīng)條件。正交實(shí)驗(yàn)因素水平表見表1。

表1 因素水平表Table 1 Factors and levels

超氧陰離子清除率=(A0-A1)/A0×100%

式中,A0為對(duì)照組吸光值,A1為樣品組吸光值。

1.2.4 茶多糖及其乙酰化產(chǎn)物清除羥自由基(·OH)活性的測(cè)定 茶多糖及其乙酰化產(chǎn)物清除·OH活性的測(cè)定采用鄰二氮菲-Fe氧化法[15]進(jìn)行:精確移取5mmol/L鄰二氮菲溶液(用蒸餾水將50mmol/L鄰二氮菲無水乙醇溶液稀釋制得)1.5mL,加入50mmol/L pH7.4磷酸緩沖液2.0mL,充分混勻,滴加1.0mL 7.5mmol/L FeSO4溶液,加好后立即混勻,分別加1mL不同濃度(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/mL)茶多糖或其乙酰化產(chǎn)物溶液,最后加0.1% H2O21.0mL啟動(dòng)反應(yīng),以水補(bǔ)充體積至10mL作為樣品管,損傷管中加H2O2不加樣品溶液,未損傷管兩者均不加,損傷管、未損傷管均以水補(bǔ)充體積至10mL,各管反應(yīng)液均置于37℃保溫60min,取出后在波長536nm處測(cè)吸光值。根據(jù)下式計(jì)算羥自由基清除率:

羥自由基清除率=(A2-A1)/(A0-A1)×100%

式中,A0為未損傷管吸光值,A1為損傷管吸光值,A2為樣品管吸光值。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析用Minitab15進(jìn)行分析,使用SPSS statistics 19進(jìn)行顯著性分析,文中其他圖表使用EXCEL完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 乙酰化茶多糖的合成制備及修飾條件的優(yōu)化

水提醇沉法提取綠茶多糖得粗茶多糖提取率為2.07%,經(jīng)過脫色和6次除蛋白得到初步純化茶多糖。以保溫時(shí)間(A)、茶多糖質(zhì)量與乙酸酐體積比(B)、反應(yīng)溫度(C)作為實(shí)驗(yàn)三因素,以制得的純化多糖為原料,參照表1各因素水平進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)。表2為實(shí)驗(yàn)因素水平表和正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果及極差分析表,正交實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次,表2中取代度為三次實(shí)驗(yàn)平均值。

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果及極差分析表Table 2 Results of orthogonal test and range analysis

由表2可知,三個(gè)實(shí)驗(yàn)因素對(duì)取代度的影響作用由大到小依次為:茶多糖質(zhì)量與乙酸酐體積比(B)>保溫時(shí)間(A)>反應(yīng)溫度(C),正交實(shí)驗(yàn)得到的最適條件為茶多糖質(zhì)量與乙酸酐體積比為1∶40,保溫時(shí)間4h,反應(yīng)溫度為30℃。在最優(yōu)條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),制得乙酰化茶多糖的取代度為0.337,表明該優(yōu)選條件穩(wěn)定可行,重復(fù)性良好。以該正交實(shí)驗(yàn)獲得的最佳反應(yīng)條件制取乙酰化茶多糖,并進(jìn)行以下清除自由基及亞硝基的實(shí)驗(yàn)。

圖1 茶多糖與乙酰化茶多糖 對(duì)超氧陰離子自由基的清除作用Fig.1 Superoxide anion free radical scavenging effect of TPS and acetylated TPS

2.3 茶多糖及乙酰化茶多糖對(duì)羥自由基(·OH)的清除作用

羥自由基是一種氧化活性很強(qiáng)的氧化劑,可直接損傷各種生物膜,導(dǎo)致多種疾病的發(fā)生,·OH清除率是抗氧化作用的重要指標(biāo)[3]。本實(shí)驗(yàn)采用鄰二氮菲-Fe氧化法測(cè)定綠茶多糖及其乙酰化產(chǎn)物對(duì)·OH的清除作用,實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2。

圖2 綠茶多糖與乙酰化綠茶多糖對(duì)羥自由基的清除作用Fig.2 Hydroxyl free radical scavenging effect of TPS and acetylated TPS

由圖2可知,茶多糖及其乙酰化產(chǎn)物對(duì)·OH的清除作用與溶液濃度正相關(guān),且乙酰化茶多糖清除活性均高于未修飾前,·OH清除活性最大提高率達(dá)36.96%。此外,當(dāng)溶液濃度為本實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)最大即1mg/mL時(shí),乙酰化茶多糖的·OH清除率達(dá)到最大值60.36%,說明乙酰化茶多糖具有較強(qiáng)的·OH清除活性，表明乙酰化修飾能夠有效地提高茶多糖對(duì)·OH的清除活性。

圖3 綠茶多糖與乙酰化綠茶多糖對(duì)亞硝基的清除作用Fig. scavenging effect of TPS and acetylated TPS

圖4 乙酰化修飾茶多糖取代度與清除活性的關(guān)系Fig.4 Relationship between modification degree and scavenging effect of acetylated tea polysaccharides

3 討論

4 結(jié)論

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LIANG Shao-ru1,XIAO Xiao2,XIAO Bin1，*

(1.College of Horticulture,Northwest A&F University,Yangling 712100,China;2.Beijing Key Laboratory of Lignocellulosic Chemistry,Beijing Forestry University,Beijing 100083,China)

2014-09-09

梁少茹(1987-)，女，碩士研究生，研究方向：茶葉生物化學(xué)。

*通訊作者:肖斌(1957-)，男，學(xué)士，教授，主要從事茶葉生理生態(tài)及茶葉生物化學(xué)研究。

國家茶葉產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(CARS-23)；陜西省科技統(tǒng)籌工程計(jì)劃難題招標(biāo)(2013KTZB02-01-01)。

TS201.2

A

1002-0306(2015)11-0084-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.11.009