一種新型藏靈菇乳清粉的制備及其理化成分檢測

郭琪禎,梅 俊,李云飛,2,*

(1.上海交通大學農業與生物學院,上海 200240;2.上海交通大學陸伯勛食品安全中心,上海 200240)

一種新型藏靈菇乳清粉的制備及其理化成分檢測

郭琪禎1,梅 俊1,李云飛1,2,*

(1.上海交通大學農業與生物學院,上海 200240;2.上海交通大學陸伯勛食品安全中心,上海 200240)

為了得到新型藏靈菇乳清粉并探究其在理化成分上的特殊性,本研究用真空冷凍干燥技術制備得到一種藏靈菇乳清粉(KTWP),并對其水分、灰分、乳糖、蛋白質、氨基酸含量等理化指標進行檢測,利用掃描電鏡觀察藏靈菇內部菌種結構和藏靈菇乳清粉表面結構。研究表明,實驗得到的乳清粉中水分4.93%,灰分10.09%,乳糖60.63%,粗蛋白8.65%,符合國標,復水性較好。藏靈菇乳清粉(KTWP)檢測出17種水解氨基酸,其中芳香族氨基酸的比率與乳清蛋白粉(WPC-34)相比含量偏高,脂肪族氨基酸比率偏低。新型藏靈菇乳清粉中存在16種游離氨基酸,其種類和含量均高于粗蛋白含量約為34%的乳清蛋白粉WPC-34。

藏靈菇,乳清粉,理化成分,氨基酸,掃描電鏡

乳清是奶酪加工的副產物,其不僅保留了牛奶中20%以上的蛋白質,并含有牛奶中全部的乳清蛋白,乳清蛋白被認為是黃金標準蛋白,無論是可溶性還是必需氨基酸的含量均高于酪蛋白等其他蛋白質[1],同時含有脂肪、維生素等營養物質[2]。乳清若處理不當,對環境有一定的破壞作用,但其是功能性蛋白質、肽類、脂質、礦物質和乳糖的極好來源。目前乳清粉及乳清蛋白已經成為具有高價值并被廣泛應用的食品原料[3-4]。

藏靈菇菌是用于生產傳統低酒精酸牛乳“開菲爾”的發酵劑,呈凝膠狀白色或者奶油色,直徑為0.3～3.5cm,不規則狀[5]。藏靈菇菌在發酵牛乳過程當中,總氮的含量會升高,尤其是水溶性氮和酸溶性氮,增加尤為顯著[6],另外有研究表明開菲爾作為一種發酵劑應用在乳制品中能夠延長乳制品的貨架期[7]。

基于藏靈菇菌的特殊發酵特性,藏靈菇乳清粉會有較特殊的理化特性,尤其是水解氨基酸和游離氨基酸。本研究用真空冷凍干燥的方法制備得到一種新型藏靈菇乳清粉[8],并對其主要理化特性進行檢測,為之后對藏靈菇乳清粉的進一步研究做鋪墊。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

藏靈菇菌 西藏當雄寺廟;UHT無抗純牛奶 光明乳業;生牛乳 光明乳業牧場;WPC-34 市售(營養指標如表1所示);凝乳酶 美國杜邦化工集團(中國)有限公司;磷酸二氫鈣,乙腈(分析純),三乙胺(分析純),乳糖(分析純) 國藥集團。

FD-1冷凍干燥機 上海田楓實業有限公司;LD-T250多功能粉碎機 上海頂帥電器有限公司;1.5-10T 1000℃一體型馬弗爐 上海慧泰儀器制造有限公司;ATN-300型全自動凱氏定氮儀 上海洪紀儀器設備有限公司;DHG-9240A電熱鼓風干燥箱 上海一恒科學儀器有限公司;L-8900全自動氨基酸檢測儀 日立Hitachi;H-class 超高效液相色譜儀 Acquity ELSD檢測器 美國waters;METJLER TOLEDO實驗pH計(FE20) 儀器(上海)有限公司。

表1 市售WPC-34營養指標Table 1 The nutritive index of the commercially WPC-34

1.2 實驗方法

1.2.1 發酵劑制備 將藏靈菇放置于3%(w/v)無抗純牛乳中,保持奶溫28℃發酵24h,濾出藏靈菇菌,濾出液作為發酵劑[9-10]。

1.2.2 乳清制作 80～85℃加熱生牛乳20～30s,冷卻至30～35℃,加入8%(g/mL)的發酵劑[9-10],保持奶溫30℃發酵1.5h,加入0.55g/L磷酸二氫鈣和0.5g/L凝乳酶,攪拌1min,30℃凝乳1.5h,切割,0.5h內將溫度從30℃緩慢升至40℃,保持40℃排乳清1.5h,紗布過濾,收集乳清。8500r/min,5℃離心15min,收集黃綠色透明的上清液4℃保存[11]。

1.2.3 乳清粉制作 將乳清倒入培養皿內,保證高度不超過1cm,-80℃急凍2h,轉移至真空冷凍干燥箱內,進行真空冷凍干燥12h,收集干燥后的乳清,多功能粉碎機打粉30s,收集乳清粉真空包裝4℃保存[12]。

1.2.4 水分、灰分的檢測 水分和灰分按照國標方法進行檢測[13-14]。

1.2.5 乳糖的檢測 色譜條件為:色譜柱:Acquity BEH Amide柱(100mm×2.1mm i.d.;1.7μm;Waters,Milford,MA,USA);流動相:A(乙腈∶水=80∶20 0.2%三乙胺),B(乙腈∶水=30∶70 0.2%三乙胺),A:90%,B:10%;柱溫:35℃;樣品溫度:室溫;進樣量:2μL;流速:0.13mL/min;ELSD條件:漂移管溫度:40℃;載氣:氮氣;氣體壓力:40.0Psi;數據率:10pps;噴霧模式:冷卻;檢測時間:11min;每樣進三針。

稱取1g乳清粉(精確至0.1mg)于50mL容量瓶中,加15mL加熱至50～60℃的水溶解,超聲波振蕩器震蕩10min,用乙腈定容至刻度,混勻后靜置數分鐘過濾。取5mL過濾液于10mL容量瓶中,用乙腈定容,通過0.22μm濾膜過濾。用于UPLC分析[15]。

配制0.25、0.5、0.667、1、2mg/mL標準乳糖溶液,用于繪制乳糖標準曲線,以峰面積Y為縱坐標,進樣量X(mg/mL)為橫坐標作圖。

1.2.6 粗蛋白的檢測 稱取2g乳清粉,將樣品放入消化管,加入兩片消化片,把消化管放入已預熱至4200℃的消化爐中,消化2h,樣品呈透明綠色液體。取出冷卻15min,將消化管放入自動凱氏定氮儀中。加入80mL超純50mL氫氧化鈉、30mL吸收液。關上安全門待儀器自動蒸餾,滴定[16]。

1.2.7 氨基酸檢測 通過全自動氨基酸分析儀茚三酮柱后衍生法對乳清中水解氨基酸進行檢測分析,每樣進三針[17-18]。

標準溶液Amino Acids Mixture Standard Solution,Type H.(Wako Pure ChemicalIndustries,Ltd.,Osaka,Japan)配制:取0.400mL氨基酸混合標準溶液用水定容至10.000 mL;氨基酸分析儀分離柱:4.6mm I.D.×60mm L packed with Hitachi custom ion exchange resin(Partical size:3μm);進樣量:20 μL;檢測波長:570nm(VIS 1),440nm(VIS 2)。

1.2.7.1 水解氨基酸的檢測前處理 精確稱取15～20mg樣品放入水解樣品瓶中,加入適量6mol/L HCl溶液,充氮氣約8min,密封。將樣品瓶放在110℃恒溫干燥箱內水解22h。水解結束后,冷卻至室溫,過濾定容并搖勻。取濾液55℃ 氮氣吹干后,用0.02mol/L HCl充分溶解、搖勻,調pH至1.7～2.2之間,用0.45μm濾膜過濾,上機檢測。

1.2.7.2 游離氨基酸的檢測前處理 稱取100mg乳清粉,用超純水充分溶解,定容至5mL,混勻;取1mL上述溶液,加入2倍體積10%的三氯乙酸,充分混勻,-20℃冷凍靜置15min;4℃轉速10000r/min離心15min,取上清;用0.22μm濾膜過濾樣品,過濾前棄去前3滴;調整樣品pH為2.0(用0.02mol/L的鹽酸作為基準)。

1.2.8 色氨酸測定 用醋酸鐵法測定乳清粉中的色氨酸含量[19]。

1.2.9 藏靈菇和藏靈菇乳清粉掃描電鏡檢測 將藏靈菇切成片,厚度約5mm,將小片置于pH為6.8的戊二醛中,4℃固定1.5h,用0.1mol/L,pH為6.8的磷酸緩沖液沖洗3次,每次10min。分別用體積分數為50%,70%,80%,90%的乙醇進行脫水,每次10～15min。再用99.5%酒精脫水1h,將脫水后的樣品放入ES203(HITACHI)型冷凍干燥儀對樣品進行4h干燥處理,將樣品觀察面向上,粘在掃描電鏡載物臺上,藏靈菇乳清粉固定后離子膜覆膜機鍍金,最后用掃描電鏡觀察[20]。

2 結果與討論

2.1 乳清粉

冷凍干燥后的藏靈菇乳清粉(TKWP)為純白色晶體,可能與冷凍干燥中乳糖無褐變有關[21],復水性較好,TKWP的復水性明顯優于噴霧干燥的乳清粉和乳清蛋白粉[22]。

2.2 水分、灰分檢測結果

實驗得到其水分含量為4.93%,灰分為10.09%,含量符合國標GB11674-2005中對乳清粉的要求[23]。

2.3 乳糖檢測結果

根據1.2.5中的條件繪制乳糖標準曲線,如圖1所示,得到線性回歸方程Y=1.87×107X-5.15×106,R2=0.9956。

圖1 乳糖標準曲線Fig.1 Standard curve of lactose

圖2為藏靈菇乳清溶液樣品的乳糖超高效液相圖譜,在第8～9min之間出峰。

圖2 藏靈菇乳清粉溶液樣品超高效液相色譜圖Fig.2 Ultra-high performance liquid chromatogram of Tibetan kefir whey powder

經過積分,三針藏靈菇乳清溶液樣品的峰面積的平均值為4607000,帶入線性方程得藏靈菇乳清溶液中乳糖的濃度為0.5187mg/mL。樣品中藏靈菇乳清粉的濃度為0.8555mg/mL,經過計算此種藏靈菇乳清粉中的乳糖含量為60.63%。

2.4 粗蛋白與氨基酸檢測結果

2.4.1 粗蛋白含量測定結果 TKWP的粗蛋白含量為8.65%±0.0933%。

2.4.2 水解氨基酸結果 圖3和圖4是TKWP和WPC-34的水解氨基酸色譜圖,由于檢測方法限制(氨基酸檢測儀適用于酸水解氨基酸),無法檢測出色氨酸,因此用氨基酸檢測儀對除色氨酸以外的17種水解氨基酸做了精確的定量。

圖5為色氨酸的標準曲線,以吸光度y為縱坐標和色氨酸濃度x為橫坐標作圖,線性回歸方程為y=0.0012x+0.095,R2=0.9994,經過計算KTWP的色氨酸濃度為2278.1825μg/g,WPC-34的色氨酸濃度為5504.0147μg/g。

圖3 KTWP水解氨基酸色譜圖Fig.3 Amino acid hydrolysis chromatogram of Tibetan kefir whey powder

圖4 WPC-34水解氨基酸色譜圖Fig.4 Amino acid hydrolysis chromatogram of WPC-34

圖5 色氨酸標準曲線Fig.5 Standard curve of Tryptophan

通過SASS軟件分析每種水解氨基酸占總水解氨基酸比例,如圖6所示,結果顯示TKWP和WPC-34的水解氨基酸中有6種氨基酸的含量存在顯著性差別(p<0.01)。TKWP水解氨基酸中的脯氨酸(Pro)、色氨酸(Trp)和谷氨酸(Glu)在水解氨基酸中的比率顯著高于WPC-34,但是其亮氨酸(Leu)、天冬氨酸(Asp)、丙氨酸(Ala)、半胱氨酸(Cys)的比率明顯低于WPC-34。此外TKWP的游離氨(NH3)的比率是WPC-34的兩倍。

分析圖6可以發現,KTWP的水解氨基酸中的芳香族氨基酸(色氨酸Trp、苯丙氨酸Phe)比率均高于WPC-34,脂肪族氨基酸(亮氨酸Leu、異亮氨酸Ile、丙氨酸Ala、甘氨酸Gly、)均低于WPC-34。

表3 游離氨基酸含量表Table 3 Content of free amino acids

由表2得到KTWP水解必需氨基酸的比率略少于WPC-34的必需氨基酸的比率。

2.4.3 游離氨基酸檢測結果 TKWP含有16種游離氨基酸,WPC-34含有11種游離氨基酸(除去游離氨NH3),雖然TKWP的蛋白質含量較低,但是其游離氨基酸種類和含量均高于WPC-34。此外TKWP游離氨基酸必需氨基酸的含量是WPC-34的3倍左右,TKWP的游離氨基酸中必需氨基酸的比率是WPC-34的2倍左右。

圖6 KTWP和WPC-34水解氨基酸百分比對比圖Fig.6 Percentage comparison chart of hydrolysis amino acid of TKWP and WPC-34

項目TKWP(ng·mg-1)WPC-34(ng·mg-1)酸水解氨基酸含量74019.4070361492.0110色氨酸含量2278.18255504.0147水解氨基酸總量76297.5895366996.0257必需氨基酸/水解氨基酸41.45%45.39%

TKWP和WPC-34的游離氨基酸中谷氨酸(Glu)、磷酰化絲氨酸(P-Ser)的含量較高,其他游離氨基酸的含量存在較大差別。

TKWP和WPC-34存在8種共有的游離氨基酸;TKWP含有7種WPC-34不存在的游離氨基酸,其中的4種為天然氨基酸(天冬氨酸Asp、亮氨酸Leu、酪氨酸Tyr、組氨酸His),包括了1種必需氨基酸(亮氨酸Leu);TKWP和WPC-34相比缺少了3種游離氨基酸,其中的蘇氨酸(Thr)為必需氨基酸。

2.5 藏靈菇與KTWP電子掃描顯微鏡(SEM)掃描結果

實驗中所用藏靈菇呈白色,菜花朵狀,藏靈菇是一個共生體,由特有的開菲爾多糖形成網絡結構,分層較多,每一個分層都具有不同的菌相。同時開菲爾多糖能夠保護藏靈菇菌不受外界微生物的侵染,霉菌等不能破壞藏靈菇菌內部,它釋放的酶也不能將分層破壞掉。使藏靈菇保持完整的個體。

從圖7a可以清晰地看出,藏靈菇內部的優勢菌種為桿菌,并有少量球菌,因此可以看出這是一個酵母菌和乳酸菌的共生體系[24]。高潔等[25]曾拍攝過藏靈菇的電鏡掃描圖,與本實驗所拍攝的藏靈菇在菌落數量和分布狀態上均有很大的差別,可見藏靈菇的培養環境確實會對其生長造成很大的影響。

圖7b是藏靈菇乳清粉表面的SEM圖片,在20000的放大倍數下,仍然呈現比較平整的狀態,說明此乳清粉的顆粒較小,復水性良好。

圖7 藏靈菇和藏靈菇乳清粉掃描電鏡結果(20000倍)Fig.7 SEM result of Tibetan kefir and Whey Powder(×20000)

3 結論

3.1 新型藏靈菇乳清粉(TKWP)無顆粒物,復水性較好,含有水分4.92%、灰分10.09%、乳糖60.63%、粗蛋白8.65%,符合國標GB11674-2005。

3.2 TKWP檢測出17種天然水解氨基酸,不存在半胱氨酸(Cys)。其谷氨酸(Glu)、脯氨酸(Pro)、色氨酸(Trp)、游離氨(NH3)在水解氨基酸中的比率顯著性高于WPC-34。

與WPC-34相比,TKWP水解氨基酸中的芳香族氨基酸的比率較高,而脂肪族氨基酸的比率偏低。KTWP中必需氨基酸占水解氨基酸的比率也略低于WPC-34。

3.3 TKWP含有16種游離氨基酸,多于WPC-34的11種,其必需氨基酸的含量為WPC-34的3倍左右;游離氨基酸中谷氨酸(Glu)和磷酰化絲氨酸(P-Ser)的含量較高。

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Preparation and physicochemical composition test of Tibetan Kefir whey powder

GUO Qi-zhen1,MEI Jun1,LI Yun-fei1,2,*

(1.School of Agriculture and Biology,Shanghai Jiao Tong University,Shanghai 200240,China;2.Bor Luh Food Safety Center,Shanghai Jiao Tong University,Shanghai 200240,China)

In order to produce a new kind of whey powder and explore its particularity in the physical and chemical composition,Tibetan Kefir was chosen as the research object to conduct the investigation. Vacuum freeze-drying method was used to produce this new kind of new whey powder and scanning electron microscope was used to describe the colony distribution inside Tibetan kefir and the surface structure of the Tibetan kefir whey powder. The physical and chemical compositions of Tibetan kefir whey powder were detected and it contained 4.93% moisture,10.09% ash,60.63% lactose and 8.65% crude protein which were in line with the national standard of whey powder. It was found that Tibetan kefir whey powder had excellent solubility and had 17 hydrolysis amino acids in which the ratio of aromatic amino acids was higher than whey powder protein 34 and on the other hand the aliphatic ones was lower. Tibetan kefir whey powder had 16 kinds of free amino acids which was more than whey powder protein 34 no matter on the numbers or species.

Tibetan Kefir;whey powder;physicochemical composition;amino acids;scanning electron microscope

2014-08-20

郭琪禎(1990-)，女，碩士研究生，研究方向:食品工程。

*通訊作者:李云飛(1954-)，男，博士，教授，研究方向:食品質構與流變學。

十二五“國家科技支撐計劃”項目子項目(2013BAD18B02)。

TS252.42

A

1002-0306(2015)11-0088-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.11.010