響應面法優化麥麩中植酸的提取條件及植酸抑菌效果分析研究

汪洋點點,雷 宜,張夢梅,李 元,李 智,張志清

(四川農業大學食品學院,四川雅安 625014)

響應面法優化麥麩中植酸的提取條件及植酸抑菌效果分析研究

汪洋點點,雷 宜,張夢梅,李 元,李 智,張志清*

(四川農業大學食品學院,四川雅安 625014)

以麥麩為原料,采用鹽酸提取麥麩中植酸。在單因素實驗的基礎上,選擇提取時間、提取溫度、酸浸液濃度和料液比為自變量,植酸含量為指標,通過響應面法優化植酸提取的工藝條件,建立了植酸提取的二次多項式數學模型,并得到最佳工藝條件。采用牛津杯法研究了其對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和沙門氏菌的抑菌譜及最小抑菌濃度;探討了不同濃度、金屬陽離子及濃度、溫度和有機溶劑對其抑菌效果的影響。結果表明:麥麩中植酸提取的最佳工藝條件為:提取時間2.2h,提取溫度40℃,酸浸液濃度1.2mol/L,料液比1∶22(g/mL)。經驗證在最佳提取工藝下,植酸的含量為1.215%。植酸提取液對四種細菌均有較好的抑制效果,最小抑菌濃度依次為2.17、2.89、3.61、3.61μg/mL;隨著植酸提取液濃度增大,抑菌效果增強;分別與100、200、300mmol/L的氯化鈉、氯化鉀、氯化鎂、氯化鈣溶液混合,抑菌效果減弱;與10%(v/v)乙醇、丙二醇、丙三醇等有機溶劑混合后,其抑菌效果明顯下降;經0、65、121℃處理后的植酸提取液的抑菌效果無明顯變化。

麥麩,植酸,響應面法,提取,抑菌效果

植酸(phytic acid)又名肌醇六磷酸酯,學名稱為環己六醇六磷酸酯,是淡黃色或黃褐色粘稠狀液體,呈強酸性,易溶于水、乙醇、丙二醇和甘油等,幾乎不溶于醚、苯、乙烷和氯仿等,遇高溫則分解[1]。麥麩是制粉過程中提取小麥粉和胚芽后的殘留部分,主要用作飼料,其經濟附加值很低。因此,如何利用麩皮中的功能性成分成為現代食品和糧油加工的研究熱點。研究表明,麥麩中含有4%～5%的植酸[2],是制取植酸的良好來源。植酸在醫藥、化工、紡織工業、食品等輕工業中均有廣泛的用途[3]。

生產中一般采用提取法制取植酸[4-5],主要有菲丁法、萃取法和膜分離法。有關植酸含量的測定方法大致可分為酶法[6]、分光光度法[7]、現代儀器法[8-9]、比色法[10]等。近年來植酸在我國得以迅速發展,優化出經濟、高效的植酸提取工藝條件,是提高產品質量及經濟效益的重要環節。因此,本文以麥麩為原料,從麥麩中提取植酸,以植酸含量為指標,研究提取不同提取條件(提取時間、提取溫度、酸浸液濃度、料液比)對植酸得率的影響。在單因素分析的基礎上,以植酸含量為響應值,進行響應面實驗優化麥麩中提取植酸的工藝條件。同時,在測定植酸提取液對食品中常見細菌最小抑菌濃度的同時,研究了其在不同條件下(濃度、金屬陽離子、濃度、溫度和有機溶劑)的抑菌效果,為麥麩功能的綜合開發利用提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

麥麩 雅安市售;大腸桿菌(Escherichiacoli):菌株編號ATCC 25922、金黃色葡萄球菌(Staphyloccocusaureus):菌株編號ATCC 25923、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis):菌株編號CICC 21482、沙門氏菌(Salmonella):菌株編號CTCC 21482均由四川農業大學食品學院微生物實驗室鑒定保存。

牛肉膏、蛋白胨 均購自北京奧博星生物技術有限責任公司;氯化鈉、氯化鈣、瓊脂、氯化鎂、氯化鉀、氫氧化鈉、鹽酸、乙醇、丙二醇、丙三醇、植酸(50%高純度植酸液體) 均購自成都科龍化學試劑廠;0.22μm水系微孔濾膜購自鄭州市國達儀器設備有限公司;一次性注射器購自杭州紹峰科技有限公司;HD-542型牛津杯購自北京杰瑞恒達科技有限公司;游標卡尺購自廣州市新徠測繪儀器有限公司。

CCP225D型電子天平 德國賽多利斯股份公司;UV-3100PC型紫外分光光度計 上海美譜達儀器有限公司;KH-50B型超聲波破碎儀 昆山禾創超聲儀器有限公司;HH-2數顯恒溫水浴鍋 江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司;Thermo BR4i冷凍離心機 美國Thermo公司;SYQ-DSX-280B型手提式不銹鋼壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫療器械廠;SW-CJ型潔凈工作臺 蘇州安泰空氣技術有限公司;HZQ-A型恒溫振蕩培養箱 上海一恒科學儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 麥麩中植酸提取方法的優化

1.2.1.1 植酸含量的測定方法 參考王國蓉[11]等的方法,并做一定修改。準確稱取2g粉碎后的麥麩置于250mL燒杯中,采用鹽酸浸提,超聲破碎15min后,置于恒溫水浴鍋中保溫酸浸一定時間,離心(4500r/min,10min),取2mL所得植酸粗提液,用蒸餾水定容至10mL,加入2滴10%的磺基水楊酸,用硫代硫酸鈉標樣標定了濃度的三氯化鐵溶液滴定至溶液呈紫色且30s內不褪色。植酸含量按下式進行計算。

式中:α為稀釋倍數;c為三氯化鐵溶液的濃度,mol/L;V為消耗三氯化鐵溶液的體積,mL;0.2375為每分子植酸可絡合 2.8個Fe3+,1mol 三氯化鐵相當于0.2357g植酸;W為樣品干基質量,g。

1.2.1.2 提取方法的優化 參考羅倉學[12]等的方法,并做一定修改。以植酸含量為指標,分別選取提取時間、提取溫度、酸浸液濃度與料液比進行麥麩中植酸提取的單因素優化實驗。對每個單因素進行方差分析,驗證該因素是否具有顯著性,具有顯著性的因素入選響應面分析的因素。在單因素基礎上,采用Box-Behnken中心組合設計原理,進行四因素三水平的響應面實驗對植酸提取的工藝條件進行優化。采用多元二次回歸方程擬合因素與響應值之間的函數關系,通過回歸方程優化工藝參數,預測響應值,并對影響實驗過程的因子及其交互作用進行評價,確定最佳反應條件。實驗因素及水平見表1。

表1 因素水平編碼表Table 1 Variables and levels in response surface design

1.2.2 植酸粗提液對食品中主要致病菌的抑菌效果分析

1.2.2.1 植酸粗提液的制備 將一定量的麥麩按1∶20的料液比加入1mol/L的HCl,超聲15min后,在40℃的恒溫水浴鍋中保溫2h,在4500r/min下離心10mim得到的上清液經旋轉蒸發儀濃縮,即得到植酸粗提液,其含量為0.1444g/mL。

1.2.2.2 抑菌譜的測定 參考倪清艷[13]等的方法,挑取活化后的供試菌,接種于營養肉湯培養基中,37℃培養24h,取其培養物稀釋至含菌量106～107CFU/mL,用移液槍吸取100μL的菌懸液于凝固的培養基上涂布均勻。用無菌鑷子安放牛津杯,輕輕加壓,使其與培養基接觸無間隙,將經0.22μm濾膜過濾除菌體積分數為4%的植酸粗提液100μL加入牛津杯里,設置三個平行實驗,在37℃下培養24h,用直尺測量抑菌圈直徑。用相同pH的鹽酸和4%標準植酸溶液替代提取液作為對照。

1.2.2.3 最小抑菌濃度(MIC)的測定 參考彭益強[14],王放銀[15]等的方法,取含菌量為106～107CFU/mL菌液100μL,用無菌的涂布棒在營養瓊脂平板上均勻涂布。用無菌鑷子插好牛津杯,將經0.22μm濾膜過濾除菌體積分數為1.00%、1.50%、2.00%、2.50%、3.00%的植酸粗提液100μL加入牛津杯里,設置三個平行實驗,在37℃下培養24h,用直尺測量抑菌圈直徑。

1.2.2.4 提取液濃度對植酸抑菌效果的影響 參考謝勇[16],付慧[17]等的方法,根據供試菌的最小抑菌濃度,配制不同濃度的植酸提取液,取含菌濃度為106～107CFU/mL菌液100μL,用無菌的涂布棒在營養瓊脂平板上均勻涂布。用無菌鑷子插好牛津杯,將經0.22μm濾膜過濾除菌體積分數為2.50%、3.00%、3.50%、4.00%、4.50%的植酸粗提液100μL加入牛津杯里,設置三個平行實驗,在37℃下培養24h,用直尺測量抑菌圈直徑。

1.2.2.5 金屬陽離子及濃度對植酸提取液抑菌效果的影響 參考李淑彬[18],廖愛琳[19]等的做法,配制濃度為5.78 μg/mL的植酸提取液,取1mL植酸提取液分別與1mL的100、200、300mmol/L的氯化鈉、氯化鉀、氯化鎂、氯化鈣溶液混合均勻。

取含菌量為106～107CFU/mL菌液100μL,用無菌的涂布棒在營養瓊脂平板上均勻涂布。用無菌鑷子插好牛津杯,將經0.22μm濾膜過濾除菌的各濃度溶液100 μL加入牛津杯里,設置三個平行實驗,在37℃下培養24h,用直尺測量抑菌圈直徑,以未處理的植酸提取液作為對照。

1.2.2.6 溫度對植酸提取液抑菌效果的影響 參考常麗欣[20]等的方法,并做一定修改。考慮到目前常用的滅菌溫度,配制濃度為5.78μg/mL的植酸提取液,分別在0、65、121℃保持20min,在無菌環境中冷卻至室溫。

取含菌量為106～107CFU/mL菌液100μL,用無菌的涂布棒在營養瓊脂平板上均勻涂布。用無菌鑷子插好牛津杯,將經0.22μm濾膜過濾除菌的各溶液100μL加入牛津杯里,設置三個平行實驗,在37℃下培養24h,用尺測量抑菌圈直徑,以常溫下未作處理的植酸提取液作為對照。

1.2.2.7 有機溶劑對植酸提取液抑菌效果的影響 參照秦慧民[21],楊敏[22]等方法,配制濃度為5.78μg/mL的植酸提取液,取1mL提取液分別與1mL的10%(v/v)的乙醇、丙二醇、丙三醇溶液混合。

取含菌量為106～107CFU/mL菌液100μL,用無菌的涂布棒在營養瓊脂平板上均勻涂布。用無菌鑷子插好牛津杯,將經0.22μm濾膜過濾除菌的各溶液100μL加入牛津杯里,設置三個平行實驗,在37℃下培養24h,用直尺測量抑菌圈直徑,以未處理的植酸提取液作為對照。

圖1 單因素條件對植酸提取量的影響Fig.1 Effect of extraction single factors on phytic acid yield from wheat bran

2 結果與分析

2.1 麥麩中植酸提取方法的優化

2.1.1 各單因素對植酸提取液中植酸含量的影響 由圖1a可以看出,當提取時間從1h增加至2h時,植酸含量急劇增加,2h以后植酸含量隨時間的增加呈現明顯減少的趨勢,可能是已提取出的植酸隨著提取時間的延長發生了一定程度的氧化。因此,將2h作為最佳提取時間。由圖1b可以看出,隨著提取溫度從30℃升高到40℃,植酸含量明顯增加,溫度高于40℃后植酸含量隨提取溫度的升高明顯降低。并且在實驗過程中發現,當提取溫度過高時酸浸液有明顯的異味,可能是麥麩在較長的提取時間內由于微生物作用而發生的發酵,40℃以后因溫度太高植酸發生了氧化因而含量下降。因此,將40℃選為最佳提取溫度。由圖1c可以看出,植酸含量隨酸浸液濃度的增大而增大,當酸浸液濃度為1.0mol/L時植酸含量達到最大值,隨后植酸含量有所下降。酸浸液濃度增大降低了植酸的螯合性,但當酸浸液濃度增大到一定程度后麥麩中的其他成分如蛋白質、多糖等也被溶解出,從而再次和植酸螯合,使植酸的含量降低。因此,確定提取植酸的酸浸液的最佳濃度為1.0mol/L。由圖1d可以看出,當料液比在1∶10～1∶20(g/mL)的范圍內,植酸含量隨料液比的增加而明顯增加,但料液比增加至1∶25(g/mL)時,植酸含量增加趨勢很小,隨著料液比的增大植酸逐漸被完全提取出來后植酸含量不再增加。經實驗表明料液比太小,麥麩中的植酸不能完全提出,當植酸完全提出后料液比的增大對其沒有影響,考慮工業中提取植酸的成本等因素,因此選取1∶20(g/mL)作為提取的最佳料液比。由實驗結果可以看出,最佳提取時間和提取溫度與羅倉學等[12]以菜籽粕為原料的實驗結果相一致,可能是因為在40℃和酸浸2h的條件下,能較大程度上將植酸提取出來并保持其穩定性,故出現最高點。同時由于所選取的原料不同,所含的蛋白質不同以及在浸提液中的溶解性不同,植酸以不同形式的復合物存在,導致酸浸液濃度和料液比的結果不同。但其變化趨勢仍相一致,植酸含量隨酸浸濃度的增加呈現先增后減的趨勢,隨料液比的增加出現先增加后趨于平緩的趨勢。

2.1.2 響應面實驗優化植酸提取條件 在單因素基礎上,本實驗采用Box-Behnken中心組合設計原理,對影響植酸提取較大的4個因素:X1(提取時間)、X2(提取溫度)、X3(酸浸液濃度)、X4(料液比)采用Design Expert8.0.6軟件設計四因素三水平中心實驗。因素水平編碼表見表1,響應面實驗結果見表2。

表2 Box-Behnken實驗設計及結果Table 2 Arrangement and experimental results of response surface Box-Behnken design

經Design Expert8.0.6軟件對表2的結果進行分析,得到四因素與植酸含量的回歸方程如下:

植酸含量(%)=1.18+0.025X1+0.026X2+0.070X3+0.057X4-0.019X1X2-0.014X1X3+0.050X1X4-0.018X2X3-0.024X2X4+0.046X3X4-0.069X12-0.11X22-0.045X32-0.14X42

2.1.3 響應面分析 由圖2a、圖2b可以看出,時間與料液比(X1、X4)、酸浸液濃度與料液比(X3、X4)的交互作用對植酸含量影響顯著,曲線較陡,且隨著其數值的增加或者減少響應值降低,響應值在中心有一個最大值。

圖2 交互項顯著的因素響應曲面圖Fig.2 Interactive significant factors of response surface figure注:a.提取時間與料液比;b.酸浸液濃度與料液比。

表3 植酸含量的方差分析及顯著性結果Table 3 Variance analysis for yield of Phytic Acid with various extraction conditions

注:*代表在α=0.05上差異顯著;**代表在α=0.01上差異極顯著。

表4 植酸提取液濃度對抑菌效果的影響(cm)Table 4 The influence about concentration on antimicrobial effect of phytic acid extracting solution(cm)

注：“-”表示無抑菌圈出現。對響應面和回歸方程進行分析后,得到的提取植酸的最優工藝條件是:提取時間2.24h,提取溫度39.73℃,酸浸液濃度1.19mol/L,料液比1∶22.02(g/mL)。考慮到實際操作的可行情況,將提取植酸的最優工藝條件修正為:提取時間2.2h,提取溫度40℃,酸浸液濃度1.2mol/L,料液比1∶22(g/mL)。在此條件下進行三次驗證實驗,得到的植酸含量的結果為1.215%、1.177%、1.253%,平均值為1.215%,與預測值1.225%基本相符。

2.2 植酸粗提液對食品中常見細菌的抑菌效果分析

2.2.1 植酸粗提液對食品常見細菌抑菌效果初測 采用抑菌圈法分析表明植酸提取液對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和沙門氏菌都有較好的抑制作用,通過與標準植酸和相同pH的鹽酸溶液比較發現,鹽酸的抑菌圈直徑最大,標準植酸樣品的抑菌圈直徑最小。說明植酸有抑菌作用,植酸粗提液抑菌圈直徑大于植酸標準品的原因可能是提取液中含有如酚類等其他水溶性物質,也具有一定的抑菌作用,故抑菌效果強于對照組。

2.2.2 最小抑菌濃度(MIC)的測定及不同植酸提取液濃度對抑菌效果的影響 由表4可知，植酸提取液對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和沙門氏菌的最小抑菌濃度依次為2.17、2.89、3.61、3.61μg/mL，故大腸桿菌對植酸最敏感。由于大腸桿菌和沙門氏菌是革蘭氏陰性菌，金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌是革蘭氏陽性菌，可推測植酸對革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌均有一定抑制作用。可以看出，在一定范圍內隨著植酸提取液濃度的增加，抑菌圈直徑呈現增大的趨勢，抑菌效果增強。并且不同菌的最佳抑菌濃度不同，大腸桿菌和枯草芽孢桿菌在5.78μg/mL的濃度下抑菌效果最好，金黃色葡萄球菌和沙門氏菌在6.05μg/mL的濃度下抑菌效果最好。其原因可能是不同微生物的最適pH不同，呈強酸性的植酸提取液改變其生長環境的pH，從而影響供試菌的生長。隨植酸提取液濃度的增加，大腸桿菌和枯草芽孢桿菌生長環境的pH先降低后基本保持不變；金黃色葡萄球菌和沙門氏菌生長環境的pH降低。

表5 金屬離子及濃度對植酸提取液抑菌效果的影響(cm)Table 5 The influence about metal cations & concentration on antimicrobial effect of phytic acid extracting solution(cm)

注:“-”表示無抑菌圈出現。

表6 溫度對植酸提取液抑菌效果的影響(cm)Table 6 The influence about temperature on antimicrobial effect of phytic acid extracting solution(cm)

表7 有機溶劑對植酸提取液抑菌效果的影響(cm)Table 7 The influence about organic solvents on antimicrobial effect of phytic acid extracting solution(cm)

注:“-”表示無抑菌圈出現。2.2.3 金屬離子及濃度對植酸提取液抑菌效果的影響 由表5可知,植酸提取液與不同金屬離子混合后抑菌效果相較對照組均減弱。其中對大腸桿菌的抑菌效果是:含有100mmol/L Na+的植酸提取液無抑菌圈出現,K+濃度的變化對抑菌圈直徑影響不大,隨 Mg2+濃度增大抑菌圈直徑減小,隨Ca2+濃度增大抑菌圈直徑增加;對金黃色葡萄球菌的抑菌效果是:含有100、200mmol/L Na+、300mmol/L Mg2+和100mmol/L Ca2+的植酸提取液無抑菌圈出現,隨K+濃度增大抑菌圈直徑增加;對枯草芽孢桿菌的抑菌效果是:隨Na+、Ca2+濃度增大抑菌圈直徑減小,隨K+、Mg2+濃度增大抑菌圈直徑先減后增;沙門氏菌對Na+、K+、Ca2+敏感,當加入這些離子后無抑菌圈出現,隨 Mg2+濃度增大抑菌圈直徑增加。可能是因為植酸具有極強的螯合性,與金屬離子螯合后,改變其原來的結構或影響微生物代謝酶的活性。因此植酸提取液作為防腐劑使用在含鈉、鉀、鎂、鈣離子豐富的食品中時,應考慮其抑菌效果下降的問題。

2.2.4 溫度對植酸提取液抑菌效果的影響 由表6可知,相較對照組,經0、65、121℃處理后的植酸提取液對大腸桿菌的抑菌效果減弱,0℃處理對沙門氏菌的抑菌效果略有增強,65℃處理效果減弱，121℃處理幾乎沒有影響;經0、65、121℃處理后的植酸提取液對金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的抑菌效果基本不變。說明不同處理溫度對植酸抑菌效果的影響較小。

2.2.5 有機溶劑對植酸提取液抑菌效果的影響 由表7可知,乙醇與植酸提取液混合后對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌基本沒有抑制作用,丙二醇、丙三醇與植酸提取液混合后對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和沙門氏菌都有一定的抑制效果,但相較于對照組,植酸提取液與有機溶劑混合后,抑菌效果減弱。其原因可能是植酸雖易溶于這些有機溶劑,但兩者混合后,對微生物生長環境的pH改變的能力減弱,且有機溶劑也可能作為微生物的碳源及能源,使得抑菌效果不如對照組。

3 結論與討論

本實驗在單因素實驗的基礎上,以麥麩為原料,從麥麩中提取植酸并測定植酸含量,以植酸含量為響應值,進行響應面實驗優化麥麩中提取植酸的工藝條件。優化后的提取植酸的工藝條件為:提取時間2.2h,提取溫度40℃,酸浸液濃度1.2mol/L,料液比1∶22。在此優化條件下進行三次驗證實驗,得到的植酸平均含量為1.215%,與預測值相符,且重現性好,說明響應面法優化提取植酸的工藝結果可靠。

研究發現,麥麩植酸提取液對食品中常見的4種致病菌均有明顯抑制作用,其中對大腸桿菌的抑制效果最好;植酸提取液對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和沙門氏菌的最小抑菌濃度依次為2.17、2.89、3.61、3.61μg/mL;隨植酸提取液濃度增加,抑菌效果增強;當將不同濃度的Na+、K+、Mg2+和Ca2+與植酸提取液混合后,抑菌效果受到抑制;經0、65、121℃處理后的植酸提取液抑菌效果變化較小;與乙醇、丙二醇、丙三醇混合后的植酸提取液抑菌效果也受到抑制。優化后植酸平均含量低于單因素結果可能是由于麥麩的呂種或批次差異。

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Study on the optimization of extracting phytic acid from wheat bran by response surface methodology and its antimicrobial effect

WANG Yang-dian-dain,LEI Yi,ZHANG Meng-mei,LI Yuan,LI Zhi,ZHANG Zhi-qing*

(College of Food Science,Sichuan Agricultural University,Ya’an 625014 ,China)

The phytic acid in wheat bran was extracted by solution of hydrochloric acid. Based on the single factor experiment test,the extract conditions,such as extraction time,temperature,hydrochloric acid concentration and ratio of solid to liquid were investigated and optimized by response surface methodology. Then a quadratic polynomial mathematical model of phytic acid extraction was established. The antimicrobial spectrum and the minimum inhibition concentration(MIC)ofEscherichiacoli,Staphyloccocusaureus,BacillussubtilisandSalmonellawere studied by means of oxford-cup tests. Also the antimicrobial effect of phytic acid on different concentrations,metal cations and concentration,temperature and organic solvents were discussed. The results indicated that the optimal conditions were as follows:extraction time 2.2h,extraction temperature 40℃,1.2mol/L hydrochloric acid solution,ratio of solid to liquid 1∶22(g/mL). Based on the optimal conditions,the yield of phytic acid was 1.215%. The phytic acid of wheat bran could effectively inhibit the growth of bacteria. The MIC were 2.17,2.89,3.61,3.61μg/mL respectively. The antimicrobial effect becomes stronger with the concentration increasing. The antimicrobial effect of phytic acid was weakened by combination with 100,200,300mmol/L solution of NaCl,KCl,MgCl2,CaCl2and 10%(v/v)ethyl alcohol,proplene glycol,glycerine,the antimicrobial effect of phytic acid was no difference when temperature was 0,65,121℃.

wheat bran;phytic acid;response surface methodology;extraction;antimicrobial effect

2014-09-03

汪洋點點(1992-)，女，本科，研究方向：食品質量與安全。

*通訊作者:張志清(1976-)，男，博士，教授，研究方向：糧食、油脂及植物蛋白質工程。

國家大學生創新性實驗計劃課題(1310626042)。

TS210.9

A

1002-0306(2015)11-0093-07

10.13386/j.issn1002-0306.2015.11.011