羊肚菌液體深層發(fā)酵工藝優(yōu)化的研究

滕國(guó)生，賈東旭,郭含笑,劉 勇,范春艷,武麗達(dá),佟 毅,*

(1.吉林中糧生化有限公司(玉米深加工國(guó)家工程研究中心),吉林長(zhǎng)春 130012;2.長(zhǎng)春工業(yè)大學(xué),吉林長(zhǎng)春 130012;3.吉林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,吉林長(zhǎng)春 130012)

羊肚菌液體深層發(fā)酵工藝優(yōu)化的研究

滕國(guó)生1,2，賈東旭3,郭含笑3,劉 勇1,范春艷1,武麗達(dá)1,佟 毅1,*

(1.吉林中糧生化有限公司(玉米深加工國(guó)家工程研究中心),吉林長(zhǎng)春 130012;2.長(zhǎng)春工業(yè)大學(xué),吉林長(zhǎng)春 130012;3.吉林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,吉林長(zhǎng)春 130012)

利用期望函數(shù)將菌絲體干重、胞內(nèi)多糖、蛋白質(zhì)及甘露醇含量綜合為期望值Da,并以此作為實(shí)驗(yàn)的評(píng)價(jià)指標(biāo)。應(yīng)用Plackett-Burman設(shè)計(jì)對(duì)影響羊肚菌發(fā)酵罐液體培養(yǎng)條件的因素進(jìn)行篩選,所選取的8個(gè)因素為發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH、轉(zhuǎn)速、發(fā)酵溫度、接種量、通氣量、發(fā)酵時(shí)間、種齡以及裝液量。在得到裝液量、接種量和初始pH為顯著影響因素后,利用Box-Behnken設(shè)計(jì)深入優(yōu)化。通過(guò)SAS Version 8.02軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行響應(yīng)面回歸分析,利用Matlab2012a軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)合遺傳算法分析,通過(guò)比較各模型Da預(yù)測(cè)值,即神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)合遺傳算法分析結(jié)果,從而獲得羊肚菌5L發(fā)酵罐液體培養(yǎng)最佳條件:初始pH6.83,轉(zhuǎn)速200r/min,發(fā)酵時(shí)間 4.5d,發(fā)酵溫度26℃,接種量3%,種齡3d,通氣量200L/h,裝液量 3.22L/5L。模型預(yù)測(cè)期望值0.5220,驗(yàn)證值0.4987,模型具有良好的擬合度及預(yù)測(cè)能力。

羊肚菌,液體發(fā)酵,Plackett-Burman設(shè)計(jì),神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)合遺傳算法,期望函數(shù)

羊肚菌[Morehellaesculenta],別稱羊肚菜、羊肚蘑、羊肚子,在我國(guó)分布廣泛,是世界公認(rèn)的食用菌,其不僅口感好,肉質(zhì)鮮嫩,而且富含營(yíng)養(yǎng)價(jià)值,具有良好的藥用價(jià)值[1-2]。羊肚菌富含多糖、蛋白類、氨基酸、甘露醇和脂肪酸等類成分,目前已探究其營(yíng)養(yǎng)成分具有增強(qiáng)免疫、減緩疲勞、抗腫瘤和抗氧化方面均具有顯著功效[3-4]。近年來(lái),鑒于羊肚菌野生資源逐漸匱乏同時(shí)其子實(shí)體生長(zhǎng)環(huán)境要求嚴(yán)格,其人工栽培技術(shù)尚未成熟,因此羊肚菌的液體發(fā)酵生產(chǎn)途徑是解決其工業(yè)化、集約化的重要途徑,近年來(lái)對(duì)羊肚菌液體深層發(fā)酵中培養(yǎng)基配方組分方面優(yōu)化的研究常見(jiàn)報(bào)道,諸如聶建軍等優(yōu)化黑脈羊肚菌菌絲體培養(yǎng)基配方的研究[5],吳新宇等對(duì)新疆野生羊肚菌液體培養(yǎng)基組分的研究[6]等,而針對(duì)羊肚菌液體深層發(fā)酵工藝中培養(yǎng)基配方外的培養(yǎng)條件優(yōu)化方面研究不多。

Plackett-Burman設(shè)計(jì)是一種兩水平的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法,可以利用最少的實(shí)驗(yàn)次數(shù),從眾多的考察因素中快速篩選主要的影響因素,廣泛地用于因子主效應(yīng)的估計(jì)中[7]。響應(yīng)面法包含設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案、建立回歸模型、評(píng)估因子效應(yīng)、獲得因子的最佳水平等功能,優(yōu)于正交實(shí)驗(yàn)和因子實(shí)驗(yàn)等方法,具有實(shí)驗(yàn)次數(shù)少、周期短和精度高等優(yōu)點(diǎn)[8]。遺傳算法源于生物遺傳學(xué)和適者生存的自然規(guī)律,是由美國(guó)Michigan大學(xué)Holland教授發(fā)展建立的[9]。其能夠解決有約束的最優(yōu)化問(wèn)題,只需要給出目標(biāo)函數(shù)、變量取值范圍和需滿足的其他等式和不等式的約束條件,就可以通過(guò)迭代,逐步搜索到最優(yōu)解[10]?；诨瘜W(xué)計(jì)量學(xué)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)廣泛應(yīng)用于化學(xué)、化工以及生物方面[11-13]。

本研究先利用Plackett-Burman設(shè)計(jì)對(duì)影響羊肚菌發(fā)酵罐培養(yǎng)條件的諸多因素進(jìn)行考察,對(duì)篩選得到的關(guān)鍵因素采用Box-Behnken設(shè)計(jì)深入優(yōu)化,利用Design-Expert.V8.0.6.1軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行響應(yīng)面回歸分析,利用Matlab2012a軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)合遺傳算法分析,通過(guò)比較,獲得羊肚菌5L發(fā)酵罐液體培養(yǎng)最佳條件。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

羊肚菌菌株,為中科院微生物所菌種保存中心購(gòu)得CGMCC5.620。

甘露醇 標(biāo)準(zhǔn)品美國(guó)Sigma公司;甲醇 北京化工色譜;高碘酸鈉、鹽酸、MgSO4·7H2O、KH2PO4·3H2O、葡萄糖均為分析純 購(gòu)于北京化工廠;維生素B1、蔗糖、蛋白胨、酵母浸粉均為生化試劑 購(gòu)于北京奧博星生物技術(shù)公司。

全自動(dòng)在位滅菌發(fā)酵系統(tǒng),5L全自動(dòng)發(fā)酵罐,真空凍干機(jī),德國(guó)Eppendorf 5810R型高速冷凍離心機(jī),日本島津LC-10AT高效液相色譜儀。

1.2 培養(yǎng)方法

種子與發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖10g/L,蔗糖10g/L,蛋白胨10g/L,酵母浸粉10g/L,KH2PO4·3H2O 3g/L,MgSO4·7H2O 3g/L,VB10.1g/L。

種子培養(yǎng):500mL搖瓶裝入種子培養(yǎng)基200mL,接入5%的菌種培養(yǎng)液,26℃振蕩(150r/min)培養(yǎng),培養(yǎng)時(shí)間(種齡)按照優(yōu)化條件所需進(jìn)行。

1.3 分析方法

1.3.1 干重指標(biāo)的測(cè)定 發(fā)酵時(shí)間截止后,收集200mL發(fā)酵液,5000r/min離心10min,棄去上清,添加適量蒸餾水水洗菌絲體并離心,收集最終沉淀,冷凍干燥,稱量即可。

1.3.2 蛋白質(zhì)含量的測(cè)定 采用凱氏定氮法測(cè)定菌絲體中蛋白質(zhì)的含量[14]。

1.3.3 胞內(nèi)多糖含量的測(cè)定 采用蒽酮硫酸法測(cè)定胞內(nèi)多糖含量[15]。

1.3.4 甘露醇含量的測(cè)定 利用比色法測(cè)定菌絲體中甘露醇的含量[16]。

1.4 期望函數(shù)的建立

采用期望函數(shù)將菌絲體干重、胞內(nèi)多糖、蛋白質(zhì)和甘露醇的產(chǎn)量綜合為一個(gè)考察指標(biāo)期望值(Da),每一個(gè)考察指標(biāo)(響應(yīng)值)均按公式(1)轉(zhuǎn)換成無(wú)量綱的期望值后,通過(guò)公式(2)綜合為Da。期望函數(shù)的平衡尺度d范圍為0～1,d=0時(shí)說(shuō)明響應(yīng)值嚴(yán)重偏離目標(biāo)值,d=1說(shuō)明響應(yīng)值與目標(biāo)值接近。d隨著所期望的響應(yīng)值增加而增加。由公示得出考察指標(biāo)越重要,其權(quán)重值越高。yi值越高,Da值越大。羊肚菌發(fā)酵的考察指標(biāo)和期望最低響應(yīng)值,期望最高響應(yīng)值及權(quán)重值如表1,其中yil為該考查指標(biāo)的最低期望值,與公式(1)中Li等同,而yih為該考察指標(biāo)的最高期望值,與公式(1)中Ei等同。

式(1)

w1+w2+w3+Λwi=1

式(2)

wi為第i個(gè)指標(biāo)的權(quán)重值;n是考察變量的總數(shù)。

表1 期望函數(shù)參數(shù)表Table 1 The parameters of the desirability function

1.5 羊肚菌5L發(fā)酵罐培養(yǎng)條件優(yōu)化

1.5.1 Plackett-Burman設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn) 采用Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)對(duì)影響羊肚菌5L發(fā)酵罐液體培養(yǎng)條件的因素:發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH、轉(zhuǎn)速、發(fā)酵溫度、接種量、通氣量、發(fā)酵時(shí)間、種齡以及裝液量進(jìn)行考察,以Da作為評(píng)價(jià)指標(biāo),確定顯著影響因素。本實(shí)驗(yàn)選取的影響因素共8個(gè),選用N=12的Plackett-Burman設(shè)計(jì)表(見(jiàn)表2)。

表2 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果Table 2 The design matrix and results of Plackett-Burman design

1.5.2 Box-Behnken設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn) 以Plackett-Burman設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果為基礎(chǔ),采用3因素3水平的Box-Behnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見(jiàn)表4。利用SAS Version 8.02(SAS Institute Inc.,USA)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行響應(yīng)面回歸分析,利用Matlab2012a軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)合遺傳算法分析,通過(guò)比較獲得羊肚菌5L發(fā)酵罐液體發(fā)酵最近培養(yǎng)條件。

表4 Box-Behnken設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果Table 4 The design matrix and the results of Box-Behnken design experiment

1.5.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 按照SAS Version 8.02(SAS Institute Inc.,USA)和Matlab2012a軟件優(yōu)化獲得的5L發(fā)酵罐培養(yǎng)條件分別進(jìn)行3組平行實(shí)驗(yàn),以確定模型和優(yōu)化方法的可靠性和準(zhǔn)確性。

2 結(jié)果與分析

2.1 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

采用SAS Version 8.02(SAS Institute Inc.,USA)軟件分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果,得到多元一次方程(3)。

Y(Da)=0.3382+0.0074Z1+0.0222Z2-0.0425Z3-0.0049Z4+0.0107Z5-0.0006Z6-0.0069Z7+0.0477Z8

式(3)

決定系數(shù)(R2)用來(lái)評(píng)價(jià)模型的擬合度,R2值越接近1,模型預(yù)測(cè)能力越好。實(shí)驗(yàn)中R2=0.9949,說(shuō)明99.49%的期望值變化可以用所建立的模型解釋。F檢驗(yàn)中p值被用來(lái)評(píng)價(jià)各因素的顯著水平,當(dāng)p<0.05被認(rèn)為是具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上顯著性。回歸分析結(jié)果如表3,p=0.0024,說(shuō)明模型顯著可靠,能很好地描述實(shí)驗(yàn)因素與響應(yīng)值間的關(guān)系。各考察因素的重要性依次為Z8>Z3>Z2>Z5>Z1>Z7>Z4>Z6。其中顯著影響因素分別為裝液量(Z8),接種量(Z3),初始pH(Z2)和轉(zhuǎn)速(Z5),其他因素的置信水平低于95%,為不顯著項(xiàng)。根據(jù)方程(3)可知,發(fā)酵時(shí)間、轉(zhuǎn)速和接種量的系數(shù)為正,表明對(duì)期望值具有正效應(yīng);相反,初始pH對(duì)期望值具有負(fù)效應(yīng),該結(jié)果說(shuō)明增加發(fā)酵時(shí)間,轉(zhuǎn)速和接種量的水平或者降低初始pH有利于提高期望值,增加羊肚菌的各有效成分產(chǎn)量。鑒于裝液量(Z8),接種量(Z3)和初始pH(Z2),3個(gè)因素對(duì)結(jié)果影響處于極其顯著下,因此基于該3個(gè)因素進(jìn)行下一步優(yōu)化。

表3 Plackett-Burman設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)回歸分析結(jié)果Table 3 The results of regression analysis of Plackett-Burman design experiment

注:顯著性分析,p<0.001為***,p<0.01為**,p<0.05為*。

表5 回歸模型方差分析Table 5 The regression model analysis of variance

2.2 響應(yīng)面分析

采用SAS Version 8.02(SAS Institute Inc.,USA)對(duì)Box-Behnken設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行響應(yīng)面回歸分析,獲得經(jīng)多元二次回歸方程(4)。

Y(Da)=0.5019+0.0195V1-0.0051V2+0.0206V3-0.0047V1V2-0.0020V1V3-0.0007V2V3-0.0102V12-0.0202V22-0.0254V32

式(4)

模型中決定系數(shù)R2為0.9092,說(shuō)明90.92%的期望值變化可通過(guò)該多項(xiàng)式解釋。模型p<0.05證明了二次回歸模型具有顯著性。模型失擬項(xiàng)的F和p值分別為10.4308和0.0887,不顯著。采用t檢驗(yàn)對(duì)模型的各項(xiàng)系數(shù)進(jìn)行顯著性分析,結(jié)果如表5顯示,一次項(xiàng)(V1和V3),二次項(xiàng)(V12、V22和V32)對(duì)響應(yīng)值的影響具有顯著性(p<0.05)。根據(jù)模型預(yù)測(cè)知,在發(fā)酵罐液體培養(yǎng)條件為:初始pH6.37,轉(zhuǎn)速200r/min,發(fā)酵時(shí)間4.5d,發(fā)酵溫度26℃,接種量4.51%,種齡3d,通氣量200L/h,裝液量3.99L/5L情況下,Da預(yù)測(cè)值為0.5159。

2.3 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)合遺傳算法分析結(jié)果

應(yīng)用Matlab 2012a對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算,15組實(shí)驗(yàn)隨機(jī)分為校正集(11組)、測(cè)試集(2組)和預(yù)測(cè)集(2組),用于建立并檢測(cè)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型的適應(yīng)性和預(yù)測(cè)能力。以逼近度(Dv)值做為評(píng)價(jià)指標(biāo)優(yōu)選神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)中最佳隱含層節(jié)點(diǎn)數(shù)(公式5)。采用遺傳算法來(lái)搜索基于實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)內(nèi)最大Dv值時(shí)的最佳條件,適應(yīng)度函數(shù)的定義如公式(6)。此外,基于遺傳算法的優(yōu)化模擬將被重復(fù)使用,每次隨機(jī)初始化優(yōu)選方案的種群。不同的初始種群將用來(lái)確保每次遺傳算法開(kāi)始搜索都是始于不同搜索子集的優(yōu)化方案,幫助定位最佳方案的搜索[7]。

式(5)

Fitness=-(響應(yīng)值)

式(6)

根據(jù)Dv值,選擇11為最佳隱含層節(jié)點(diǎn)數(shù)(圖1A),最優(yōu)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型的決定系數(shù)(R2)為0.9596,說(shuō)明神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型的擬合度好。訓(xùn)練集(RMSEc)、測(cè)試集(RMSEt)和預(yù)測(cè)集(RMSEp)的均方根誤差分別為0.0101,0.0099和0.0117。當(dāng)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型建立后,采用遺傳算法優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)條件并獲得預(yù)測(cè)期望值(圖2)。優(yōu)化后羊肚菌5L發(fā)酵罐液體培養(yǎng)條件為:初始pH6.83,轉(zhuǎn)速 200r/min,發(fā)酵時(shí)間 4.5d,發(fā)酵溫度26℃,接種量3%,種齡3d,通氣量200L/h,裝液量 3.22L/5L,此條件下預(yù)測(cè)期望值為0.5220。

圖1 隱藏結(jié)點(diǎn)數(shù)對(duì)逼近度的影響Fig.1 Effect of the number of hidden nodes on Da

圖2 遺傳代數(shù)對(duì)擬合度的影響Fig.2 The effect of the number of generation on fitness

2.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

按照SAS Version 8.02和Matlab2012a優(yōu)化的羊肚菌5L發(fā)酵罐培養(yǎng)條件分別進(jìn)行3組平行實(shí)驗(yàn)。采用SAS Version 8.02軟件進(jìn)行響應(yīng)面分析得到的預(yù)測(cè)期望值為0.5159,平均驗(yàn)證結(jié)果為0.4779,誤差7.36%。利用Matlab2012a軟件進(jìn)行神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)合遺傳算法分析得到的預(yù)測(cè)期望值為0.5220,平均驗(yàn)證結(jié)果為0.4987,誤差為4.46%。通過(guò)比較,神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)合遺傳算法分析結(jié)果作為最佳的羊肚菌5L發(fā)酵罐液體培養(yǎng)條件:初始pH6.83,轉(zhuǎn)速200r/min,發(fā)酵時(shí)間 4.5d,發(fā)酵溫度26℃,接種量3%,種齡3d,通氣量200L/h,裝液量 3.22L/5L。

3 結(jié)論

本文利用期望函數(shù)將菌絲體干重、胞內(nèi)多糖、蛋白質(zhì)及甘露醇含量綜合為期望值Da,并以此作為實(shí)驗(yàn)的評(píng)價(jià)指標(biāo)。通過(guò)Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)對(duì)影響羊肚菌發(fā)酵罐液體培養(yǎng)的8個(gè)因素進(jìn)行篩選,在獲得裝液量、接種量和初始pH為顯著影響因素后,對(duì)其利用Box-Behnken設(shè)計(jì)深入優(yōu)化。分別利用SAS Version 8.02軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行響應(yīng)面回歸分析,利用Matlab2012a軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)合遺傳算法分析,通過(guò)比較各模型分析方法得到的預(yù)測(cè)期望值,綜合預(yù)測(cè)期望值和平均測(cè)定值,即神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)合遺傳算法分析結(jié)果為最佳,從而獲得羊肚菌5 L發(fā)酵罐液體培養(yǎng)最佳條件:初始pH6.83,轉(zhuǎn)速 200 r/min,發(fā)酵時(shí)間 4.5d,發(fā)酵溫度26℃,接種量3%,種齡3d,通氣量200L/h,裝液量 3.22L/5L。本研究通過(guò)采用的多種統(tǒng)計(jì)學(xué)方法科學(xué)有效的對(duì)羊肚菌5L發(fā)酵罐液體培養(yǎng)條件進(jìn)行逐步優(yōu)化,為實(shí)際生產(chǎn)提供很好的指導(dǎo)作用。

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Optimization ofMorehellaesculentasubmerge fermentation conditions

TENG Guo-sheng1,2,JIA Dong-xu3,GUO Han-xiao3,LIU Yong1,FAN Chun-yan1,WU Li-da1,TONG Yi1，*

(1.Jilin COFCO Biochemistry CO. ,LTD(National Engineering Research center of Corn Processing),Changchun 130012,China;2.Changchun University of Technology,Changchun 130012,China;3.School of Life Sciences,Jilin University,Changchun 130012,China)

Using desirability function,four indexes including mycelium dry weight,intracellular polysaccharide,protein and mannitol yield were uniformed into one expected value(Da)which was further served as the assessment criteria. In our present study,Plackett-Burman design was applied to evaluate the effects of eight variables including initial pH,rotate speed,fermentation temperature,inoculum size,ventilation volume,culture time,inoculum age and loading volume on Da value duringMorehellaesculentasubmerge fermentation via fermenter. Culture time,initial pH and rotate speed were found to influence Da value significantly and were further optimized by Box-Behnken design. The data obtained from Box-Behnken design was analyzed by both with response surface regression(SAS Version 8.02 software)and neural network combining genetic algorithm method(Matlab2012a software). After compared Da predicted value of each model,the Da predicted value of neural network combining genetic algorithm method was the highest,so that the optimumMorehellaesculentasubmerge fermentation conditions via fermenter was obtained as follows:initial pH6.83,rotate speed 200r/min,culture time 4.5d,fermentation temperature 26℃,inoculum size 3%,ventilation volume 200L/h,inoculum age 3d,and loading volume 3.22L/5L. The predicted Da value of the optimum model was 0.5220 and the experimental Da value was 0.4987. The model possesses well fitness and predictive ability.

Morehellaesculenta;submerge fermentation;Plackett-Burman design;neural network combining genetic algorithm;Desirability function

2014-07-28

滕國(guó)生(1978-)，男，博士，講師，主要從事生物發(fā)酵研究。

*通訊作者:佟毅(1963-)，男，博士，高級(jí)工程師，主要從事生物工程發(fā)酵的研究。

國(guó)家科技部重點(diǎn)支撐項(xiàng)目(2012BAL29B05)。

TS201.3

A

1002-0306(2015)11-0162-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.11.024