應用響應面法優化葉黃素降解發酵培養基

楊雪鵬,趙 越,胡仙妹,馬 科,毛多斌

(鄭州輕工業學院食品與生物工程學院，河南鄭州 450001)

應用響應面法優化葉黃素降解發酵培養基

楊雪鵬,趙 越,胡仙妹,馬 科,毛多斌

(鄭州輕工業學院食品與生物工程學院，河南鄭州 450001)

利用響應面分析法對Pantoeadispersa(Y08)菌降解葉黃素產香的培養基進行了優化。采用Box-Behnken實驗設計,選定KH2PO4、蔗糖和混合氮源(酵母膏∶天門冬酰胺=2∶1)3個關鍵因子為響應因子,以葉黃素降解率為響應值建立多元二次回歸方程,在分析各個因素的顯著性和交互作用后,確定了Pantoeadispersa菌降解葉黃素的最優培養基為:蔗糖0.97%,混合氮源(酵母膏∶天門冬酰胺=2∶1)1.38%,KH2PO40.15%,葉黃素降解率為80.03%,與理論預測值基本吻合,比優化前提高140.67%。

培養基優化,葉黃素降解,Box-Behnken設計,響應面法

葉黃素也稱黃體素,是一種含氧類胡蘿卜素,廣泛存在于果蔬、鮮花、煙草等植物中,使其具有鮮艷的顏色和極強的抗自由基能力[1-4]。在有些植物中,葉黃素是香味物質的前體物,葉黃素的降解既有重要的生物學意義又有重要的應用價值。例如,葉黃素的降解可產生β-紫羅蘭酮等芳香物質,這些芳香物質是植物花香和果香的來源[5]。在食品與果蔬加工中,葉黃素的降解對產品感官品質、色澤等的影響很大。比如,在烤煙成熟和燃燒過程中,葉黃素可降解轉化為β-大馬酮、巨豆三烯酮等,這些化合物呈現出煙草特有的香味[6-10]。葉黃素亦可通過酶的降解產生β-紫羅蘭酮、β-大馬酮等香味物質[11],它們具有濃郁的花香和果香,且香氣閾值很低,在制備香精香料方面具有重要價值[12]。

目前關于葉黃素降解的報道主要集中于物理降解和化學降解,而生物降解法尤其是利用酶和微生物來降解葉黃素產生香味物質的研究還很少[13-17]。生物法降解葉黃素與物理降解和化學降解相比較具有以下兩個方面的顯著優點:首先生物法降解利用了酶催化的專一性,得到成分相對單一的香味物質。其次,生物法降解得到的香味物質被認定為“天然成分”[18]。生物降解葉黃素將越來越受到大家的關注。

為了進一步提高葉黃素降解率,促進香味物質的生成,本研究以葉黃素降解菌PantoeadispersaY08為實驗菌株,應用響應面分析法對發酵培養基進行優化,以葉黃素降解率為響應值,探討了發酵培養基中影響葉黃素降解率的各種關鍵因素及其相互作用,最終得到培養基的最佳濃度配比。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菌株 由前期實驗,通過在萬壽菊中篩選得到一株高效降解葉黃素的菌株,經鑒定為Pantoeadispersa(簡稱Y08),后于-20℃冰箱甘油管保存備用;斜面培養基 蛋白胨10.0g、酵母膏5.0g、NaCl 1.0g、瓊脂20.0g、蒸餾水1L、pH=6.0;基礎發酵培養基 葡萄糖10.0g、酵母膏5.0g、MgSO40.1g、葉黃素0.01g、Tween-80 1.0mL、蒸餾水1L、pH=6.0。

LC-MS聯用儀 美國賽默飛世爾公司;HF Mega BE-C18柱 美國安捷倫科技公司;高速冷凍離心機 德國Herolab公司;單人雙面凈化工作臺 蘇州凈化設備有限公司;精密電子天平 賽多利斯科學儀器(北京)有限公司;溶劑微孔過濾膜有機系 天津津騰;50L立式圓形壓力蒸汽滅菌鍋 上海醫用核子儀器廠;pH酸度計 上海市實驗儀器總廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養方法 種子培養:將篩選得到的降解葉黃素Y08菌株接種于斜面培養基活化24h,接種于裝液50mL/250mL 三角瓶中,28℃,150r/min 避光培養24h即為種子液;發酵培養:按2%的接種量將種子液接種于裝液量為100mL/250mL的三角瓶中,28℃,150r/min避光培養96h。

1.2.2 生物量的測定 取10mL發酵液3000r/min離心,洗滌2次,用蒸餾水轉移菌體至稱量瓶中烘干至恒重M。

生物量(g/L)=M×100

1.2.3 葉黃素測定方法

1.2.3.1 發酵液預處理方法 發酵液在避光條件下,12000r/min離心10min,取上清液,加入等體積二氯甲烷反復萃取3次,得葉黃素的提取物,加無水Na2SO4干燥過夜,過0.45μm的有機系膜,待LC-MS分析,并有等體積不接菌培養基作為對照[19]。

1.2.3.2 LC-MS分析的條件 液相條件:選擇Thermo C18柱,常溫,進樣壓力化學電離源(APCI)作為離子源;毛細管加熱溫度:350℃;電噴霧電壓,5kV;離子源鞘氣(N2):30Arb;離子源輔助氣(N2):10Arb;碰撞氣體為高純氦氣(>99.999%);掃描范圍:m/z 200～2000全掃描;掃描速率:1scan/s。

1.2.3.3 內標的配制 用蘇丹紅I號作為內標。準確稱取0.02096g的蘇丹紅I號,用二氯甲烷定容至500mL作為內標液備用。

1.2.3.4 葉黃素標準曲線的繪制 配制的6個梯度的標準溶液根據建立的色譜條件進行LC-MS分析后,以標樣峰面積(Ai)/內標峰面積(As)為縱坐標(Y),質量濃度為橫坐標(X),繪制標準曲線。

1.2.3.5 葉黃素降解率計算公式

1.3 單因素實驗

1.3.1 培養基中碳源的優化 在每100mL基礎培養基中,接種2%的種子培養基,分別以濃度1%的葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖、糊精、殼聚糖作為碳源,在28℃、150r/min發酵培養96h,通過LC-MS法測定葉黃素含量,計算得到葉黃素降解率。再對其添加量進行優化,碳源添加量分別為:0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、4%、5%,發酵條件及測定方法同上。

1.3.2 培養基中氮源的優化 以濃度為1%的蛋白胨、酵母膏、KNO3、(NH4)2SO4、天門冬酰胺、混合碳源(酵母膏∶天門冬酰胺=2∶1、1∶1、1∶2)作為氮源,發酵條件及測定方法同上。再對其添加量進行優化,選取濃度為 0.5%、1%、2%、3%、4%、5%的混合氮源(酵母膏∶天門冬酰胺=2∶1),發酵條件及測定方法同上。

1.3.3 培養基無機鹽的優化 在以上條件確定的情況下,分別以 0.1%的 CaCl2、KCl、MgSO4、KH2PO4、FeSO4、Na2SO4的金屬離子為無機鹽離子,其余條件同上。再對其添加量進行優化,添加量分別設為 0.01%、0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%、0.30%,發酵條件及測定方法同上。

1.3.4 響應面法確定最佳培養降解條件 參考文獻[20],實驗采用Box-Benhnken實驗設計,通過單因素實驗,確定Box-Benhnken實驗的各因素水平。本實驗設蔗糖、混合氮源,KH2PO4三個因素,每個因素設三個水平,進行搖瓶發酵實驗,尋找最佳發酵培養基成分。本實驗用應用Design-Expert軟件對實驗數據進行多項式擬合回歸后,得到回歸方程,進而繪制三維響應面圖。響應面因素水平設計見表1。

表1 Box-Benhnken設計各因素及水平Table 1 Factors and levels of Box-behnken design for response surface methodology(RSM)

1.4 數據統計分析

應用Design-Expert軟件中的RSREG(Response Surface Regression)程序進行回歸計算,并對回歸方程進行方差分析和系數顯著性檢驗。

2 結果與討論

2.1 標準曲線的繪制

按照1.2.3.4方法進行檢測,結果如圖1所示。

圖1 葉黃素標準曲線Fig.1 Lutein standard curve

如圖1所示,得出線性回歸方程Y=0.0602+11.275X,相關系數R2=0.9997,結果表明葉黃素濃度在3.383～338.3μg/mL之間,與峰面積呈良好的線性關系。

2.2 單因素實驗結果

2.2.1 碳源對降解葉黃素的影響 考察葡萄糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖、糊精、殼聚糖對Y08菌株降解葉黃素能力的影響。采用基礎發酵培養基,分別添加1%不同種類的碳源,28℃、150r/min培養96h后測定生物量和葉黃素降解率,結果如圖2所示。從圖2可以看出,以蔗糖為碳源時葉黃素降解率相對較高,故選用蔗糖作碳源。

圖2 不同碳源對生物量和葉黃素降解率的影響Fig.2 Effect of different carbon sources on biomass and degradation of lutein

2.2.2 碳源濃度對降解葉黃素的影響 不同蔗糖濃度對Y08菌株降解葉黃素的影響,結果如圖3所示,當蔗糖濃度為1%時,葉黃素降解率最高。隨著蔗糖添加量的繼續增加,反而不利于葉黃素降解,其原因可能是蔗糖添加量較大時,產生底物抑制現象,從而導致葉黃素降解率下降。

圖3 蔗糖濃度對生物量和葉黃素降解率的影響Fig.3 Effect of sucrose concentration on biomass and degradation of lutein

2.2.3 氮源對降解葉黃素的影響 不同氮源對葉黃素的降解均有一定程度的促進作用,其中有機氮源酵母膏、天門冬酰胺對葉黃素降解具有明顯的促進作用。無機氮源中的KNO3、(NH4)2SO4對菌體的生長也有一定的作用,但效果不如有機氮源明顯。當以混合氮源為唯一氮源時,不同比例的混合碳源比單一碳源對葉黃素降解均有更明顯的促進作用。以YE∶LA=2∶1為最佳混合氮源,可能是該比例混合氮源中含有更豐富的氨基酸種類,從而促進葉黃素的降解。

圖4 不同氮源對生物量和葉黃素降解率的影響Fig.4 Effect of different nitrogen sources on biomass and degradation of lutein

2.2.4 氮源濃度對降解葉黃素的影響 菌株在不同濃度氮源的培養基中發酵后生物量和葉黃素降解率的測定結果(圖5)表明,氮源濃度過高或不足都會影響到菌體的生長和葉黃素的降解,當濃度過低時,很可能是由于營養物質不充分而未能給菌體提供有利的降解條件,而過高則又會抑制葉黃素降解酶的產生。實驗結果表明,當氮源濃度為1.5%時葉黃素降解率最高。

圖5 氮源濃度對生物量和葉黃素降解率的影響Fig.5 Effect of nitrogen concentration on biomass and degradation of lutein

2.2.5 無機鹽對降解葉黃素的影響 從圖6可知,選用KH2PO4葉黃素降解率最高,而選用FeSO4時,葉黃素降解率最低。原因可能是KH2PO4能有效減小H+梯度對細胞的毒害作用,能夠使菌體更好的生長。

圖6 不同無機鹽對生物量和葉黃素降解率的影響Fig.6 Effect of different inorganic salts on biomass and degradation of lutein

2.2.6 磷酸二氫鉀濃度對降解葉黃素的影響 圖7可知KH2PO4添加量在0.01%～0.15%時,葉黃素降解率隨KH2PO4量增加逐漸升高,0.15%濃度時葉黃素降解率最高。隨著KH2PO4濃度繼續增加,葉黃素降解率反而逐漸下降。其原因可能是高濃度的KH2PO4對菌體生長有一定抑制作用,從而影響葉黃素的降解率。

表3 回歸模型方差分析Table 3 ANOVA for regression model

圖7 無機鹽濃度對生物量和葉黃素降解率的影響Fig.7 Effect of inorganic salt concentration on biomass and degradation of lutein

2.3 響應面法(RSM)優化過程

響應面分析法是一種尋找多因素系統中最優條件的數理統計方法,其中最常見的是采用Box-Behnken設計原理,根據此原理,以葉黃素降解率為響應值,設計了3因素3水平的響應面分析實驗 其具體實驗方案及結果見表2。

應用Design-Expert軟件對實驗數據進行多項式擬合回歸后,得到以下回歸方程:

Y=+79.74+0.25A-3.65B+0.005C+2.88AB+0.73AC+0.070BC-3.97A2-7.73B2-4.12C2

回歸方程的方差分析結果見表3,該方程表達了葉黃素降解率與所選的3個因素之間的關系。當“Prob>F”值<0.01時,表示該項指標極顯著,當“Prob>F”值<0.05時,表示該項指標顯著。回歸方程的決定系數(R2)為0.9720,信噪比(Adequate. Precision)為23.954。這表明方程的擬合度與可信度均很高,實驗誤差較小,能夠對葉黃素降解過程進行預測與分析。整體模型的“Prob>F”值<0.01,表明該二次方程模型極顯著。混合氮源對菌株降解葉黃素的影響極顯著,蔗糖和KH2PO4影響不顯著,蔗糖與混合氮源交互作用影響極顯著。

表2 Box-Behnken實驗設計與結果Table 2 Results of Box-Behnken design

采用Design-Expert軟件繪制三維響應曲面圖(見圖8)。圖8直觀地反映了各因素交互作用對響應值的影響,其中蔗糖和混合氮源交互作用顯著,混合氮源與KH2PO4交互作用不顯著,蔗糖與KH2PO4交互作用不顯著。

圖8 各因素交互影響葉黃素降解率的響應曲面圖Fig.8 Response surface plot and contour diagram for interaction of various factors on degradation of lutein

通過圖8中的響應面立體圖可以看出,響應值存在最大值,應用Design-Expert軟件求解方程,得到葉黃素降解最優培養基組成為蔗糖0.97%,混合氮源(酵母膏∶天門冬酰胺=2∶1)1.38%,KH2PO40.15%,葉黃素降解率的預測值為80.18%。

按優化后的條件進行驗證實驗,平行實驗3次,其葉黃素降解率平均為80.03%,與理論預測值基本吻合,比優化前提高140.67%,這說明響應面法可以有效地優化葉黃素降解培養基,從而提高葉黃素降解率。

3 結論

應用Box-Behnken中心組合實驗設計方法,優化了Pantoea dispersa Y08菌降解葉黃素的培養基。結果表明,最優培養基為:蔗糖0.97%,混合氮源(酵母膏∶天門冬酰胺=2∶1)1.38%,KH2PO40.15%,培養基經優化后,葉黃素降解率增加到80.03%,較優化前有顯著提高。

[1]吳興壯,張華,王小鶴,等.制備萬壽菊葉黃素技術研究進展[J].食品工業科技,2012(6):456-459.

[2]孟麗,趙文軍.萬壽菊干花中葉黃素酯的超聲提取工藝研究[J].食品工業科技,2009(3):270-275.

[3]凌關庭.萬壽菊色素及其生理功能[J].糧食與油脂,2002(12):44-46.

[4]Sommerburg O,Keunen J E,Bird A C,et al.Fruits and vegetables that are sources for lutein and zeaxanthin,the macular pigment in human eyes[J].Br J Ophthalmol,1998,82(8):907-910.

[5]宮長榮.不同烘烤條件下煙葉色素降解規律的研究[J].煙草科技,1997(2):33-34.

[6]Wahlberg I,Kerstin K,Austin D J. Effects of flue-curing and ageing on the volatile,neutral and acidic constituents of Virginia tobacco[J]. Phytochemistry,1977(16):1217-1231.

[7]侯英,徐濟倉,王保興,等.葉黃素的熱解產物分析[J].煙草科技,2007(12):27-32.

[8]龐慧麗,李大婧,劉春泉,等.在高溫油脂中葉黃素的熱降解動力學[J].食品工業科技 ,2013(18):147-151.

[9]Gopalam A,Gopalaehari N C. Biochemical changes in leaf pigments and chemical constituents during flue-curing of tobacco[J]. Tob Res,1979,17(5):113-117.

[10]Matsubara S,Morosinotto T,Osmond C B,et al.Short and long-term operation of the lutein-epoxide cycle in light-harvesting antenna complexes[J]. Plant Physiology,2007,144(2):926-941.

[11]Marie F N,De Gaulejac N V,Nicolas V,et al.Characterization of carotenoids and degradation products in oak wood incidence on the flavour of wood[J]. Comptes Rendus Chimie,2004(7):689.

[12]Wache Y,Deratuld A,Belin J M.Dispersion of carotene in process of production of ionone by cooxidation using enzyme-generated reactive oxygen species. Process Biochemistry,2006,41(11):2337-2341

[13]繆明明,王昆文,李鮮,等.葉黃素的化學降解產物及機理研究[J].煙草科技,1998(2):30.

[14]劉金霞,李元實,姬小明,等.葉黃素氧化降解產物GC-MS分析及在卷煙加香中的應用[J].鄭州輕工業學院學報:自然科學版,2011,26(2):24-26.

[16]羅昌榮,趙震毅,劉涵剛,等.類胡蘿卜素裂解溫度對其裂解產物的影響[J]. 無錫輕工大學學報,2003,22(3):67-75.

[16]張永濤,劉惠芳,張東豫,等. 類胡蘿卜素的熱裂解研究[C]. 中國煙草學會工業專業委員會煙草化學學術研討會論文集,海南:中國煙草學會,2005:335-339.

[17]楊偉祖,謝剛,王保興,等.煙草中β-胡蘿卜素的熱裂解產物的研究[J]. 色譜,2006,24(6):611-614.

[18]Uenojo M,Marostica M R,Pastore G M. Carotenóides propriedades aplica??es e biotransforma??o para forma??o de compostos de aroma. Química Nova,2007,30(2):616-622.

[19]王睿,孫德亞,王艷,等.高效液相法測定萬壽菊顆粒中葉黃素的含量[J].特產研究 ,2013(3):61-64.

[20]曾東慧,張俊,陸勝民.響應曲面法提取溫州蜜柑果皮中類胡蘿卜素的工藝優化[J].食品工業科技 ,2013(19):183-187.

Optimization of fermentation medium for lutein degradation applying response surface methodology

YANG Xue-peng,ZHAO Yue,HU Xian-mei,MA Ke,MAO Duo-bin

(Food and Bioengineering College,Zhengzhou University of Light Industry,Zhengzhou 450001,China)

Optimization of fermentation medium using for lutein degradation to form important aroma compounds withPantoeadispersaY08 strain was performed employing the response surface analysis(RSA)method. Based on single factor experiment,three critical factors(the content of sucrose,mixed nitrogen sources and KH2PO4)were selected as response factors. The quadric regression equation was established according to the lutein degradation yield. As a result,the optimum fermentation medium was composed of sucrose 0.97%,mixed nitrogen sources(yeast extract∶asparagine=2∶1)1.38% and KH2PO40.15%. Under the situation,the highest yield of degradation of lutein was predicted to be 80.03%. After optimization,the lutein degradation yield was increased by 140.67%. The experimental values were in according with the predicted values.

fermentation medium optimization;degradation of lutein;Box-Behnken design;response surface methodology

2014-07-11

楊雪鵬(1973-)，男，博士，副教授，研究方向：煙草工程與酶工程。

國家自然科學基金(21276084);煙草工業生物技術重點實驗室課題。

TS201.3

A

1002-0306(2015)11-0167-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.11.025