黑曲霉XSY0607以纖維素為原料發酵生產檸檬酸培養基優化研究

孫 科,周鳳俠

(1.徐州生物工程職業技術學院生物工程系,江蘇徐州 221006;2.中央農業廣播學校徐州分校,江蘇徐州 221000)

黑曲霉XSY0607以纖維素為原料發酵生產檸檬酸培養基優化研究

孫 科1,周鳳俠2

(1.徐州生物工程職業技術學院生物工程系,江蘇徐州 221006;2.中央農業廣播學校徐州分校,江蘇徐州 221000)

通過對黑曲霉(Aspergillusniger)XSY0607液體深層發酵檸檬酸的培養基優化實驗,得出如下結論:通因實驗得出黑曲霉XSY0607發酵檸檬酸的最佳碳源為水稻秸稈、最佳有機氮源為蛋白胨、最佳無機氮源NH4NO3、最佳生長因子為牛肉膏。通過Plackett-Burman實驗設計得到黑曲霉XSY0607發酵檸檬素的最佳培養基配方為:水稻秸稈粉6%、蛋白胨4.5%、NH4NO30.5%、牛肉膏0.75%、KH2PO40.15%、MgSO40.045%和FeSO4·7H2O 0.0015%。同時通過極差分析還可得出黑曲霉XSY0607發酵培養基中不同成分對檸檬酸發酵的影響順序為水稻秸稈>蛋白胨>NH4NO3>KH2PO4>MgSO4>FeSO4·7H2O>牛肉膏。使用優化后的培養基進行檸檬酸發酵實驗,檸檬酸產量為83.6mg/mL,較優化前產量提高了31.83%。

黑曲霉XSY0607,水稻秸稈,液體深層發酵,培養基優化

檸檬酸及其衍生物作為添加劑被廣泛應用于食品、醫療、化工等行業,目前是世界上產銷量最大的有機酸。近20年來我國檸檬酸發酵工業迅猛發展,年生產量約占世界檸檬酸總生產量的70%,是目前世界上最大的生產國和出口國[1]。傳統的檸檬酸發酵都采用玉米、木薯等農作物帶渣發酵。發酵生產檸檬酸糧食消耗占生產成本的 65%左右,由于世界范圍需求量不斷增加,應當不斷開發探尋新的原料,從而實現我國檸檬酸發酵產業的可持續發展[2]。在“不與人爭糧,不與糧爭地”的原則指導下,采用糖蜜、秸稈等農副產品發酵檸檬酸成為近幾年來的研究熱點。目前國內外的研究主要集中在黑曲霉發酵秸稈產纖維素的研究:張福元等[3]利用玉米秸稈研究產生纖維素酶,謝宇等[4]用麩皮采用液體發酵研究發酵產纖維素酶,鄔敏辰等[5]用水稻秸稈采用固體發酵纖維素酶。對于以秸稈為原料發酵檸檬酸的培養基研究幾乎沒有。本文通過研究實驗室保藏菌種黑曲霉XSY0607利用纖維素發酵檸檬酸的培養基優化,為檸檬酸發酵工業探尋新的發酵原料提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

水稻秸稈 采自徐州市大彭鎮某村,粉碎過60目篩;麩皮 市售,過60目篩;黃豆餅粉 市售,過60目篩;(NH4)2SO4、MgSO4、CaCl2、KH2PO4、ZnCl2實驗室保藏,分析純;蛋白胨、酵母膏、牛肉膏 實驗室保藏,化學純。

黑曲霉(Aspergillusniger)XSY0607 實驗室保藏菌種;斜面培養基 羥甲基纖維素鈉(CMC)0.5%,酵母膏0.15%,(NH4)2SO40.2%,瓊脂2%,pH自然[6-7];種子培養基 水稻秸稈粉5%,小麥麩皮0.5%,(NH4)2SO40.25%,玉米粉1%,CaCl20.1%,pH自然[8];發酵培養基 水稻秸稈粉5.5%,(NH4)2SO40.16%,MgSO40.02%,蛋白胨3%,KH2PO40.2%,CaCl20.001%,ZnCl20.0002%,尿素0.02%,pH5.0[9-10]。

CS501-SP恒溫水浴鍋 重慶慧達實驗儀器有限公司;FA1204B電子分析天平 上海精科天美貿易有限公司;LRH-70生化培養箱 上海齊欣科學儀器有限公司;XSP-SG-63X顯微鏡 上海光學儀器廠;723N可見分光光度計 上海儀電分析儀器有限公司;MP512-03精密pH計 上海精密儀器儀表有限公司;LC-100高效液相色譜 上海伍豐科學儀器有限公司;7L實驗室不銹鋼發酵罐 鎮江貝利生物工程有限;SW-CJ-2F超凈工作臺 上海陽光實驗儀器有限公司;TGL-18C高速臺式離心機 上海安亭科學儀器廠;MLS-3780高壓蒸汽滅菌鍋 杭州亞旭生物科技有限公司;Ba-1旋轉式搖床 江蘇省金壇市環宇科學儀器廠;FCW系列超微粉碎機 青島即墨市超微粉碎機廠 。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株培養方法 在無菌條件下,取出保藏的菌種黑曲霉(Aspergillusniger)XSY0607,接種到斜面培養基上,30℃活化培養48h,然后轉接如茄形瓶中,30℃恒溫培養24h。再用無菌水洗下茄形瓶中成熟孢子,接入500mL三角瓶裝有50mL種子培養基,30℃150r/min震蕩培養28h。然后將種子液以10%～15%[11]的接種量轉接至裝有發酵培養基的7L小型不銹鋼發酵罐中,通風攪拌培養[12]。每隔8h取樣測定檸檬酸的產生情況和底物的消耗情況,等到黑曲霉菌絲開始自溶時終止培養,分離黑曲霉菌體和發酵液。每批次都按此方法。

1.2.2 產物分析的方法 總酸測定:取1mL經過普通濾紙過濾過的檸檬酸的發酵濾液用0.1429N的NaOH滴定,所消耗的NaOH毫升數即為總酸度。檸檬酸含量測定:采用高效液相色譜法測定檸檬酸的含量[13-15]。總糖測定:采用6mol/L的硫酸水解后,用菲林試劑法測定;還原糖測定:直接采用菲林試劑法測定。

1.2.3 發酵培養基優化

1.2.3.1 培養基成分單因素優化實驗 碳源優化:分別以過60目篩的5%水稻秸稈粉、小麥秸稈粉、玉米秸稈粉、木屑和青草粉等作為碳源,進行檸檬酸發酵,以確定最佳碳源。

有機氮源優化:分別以過60目篩的5%黃豆餅粉、酵母膏、蛋白胨、玉米漿和尿素等作為有機氮源,進行檸檬酸發酵,以確定最佳有機氮源。

無機氮源優化:分別以0.5% NaNO3、(NH4)2SO4、KNO3、NH4NO3和NH4Cl作為基礎培養基中的無機氮源,進行檸檬酸發酵,以確定最佳無機氮源。

生長因子優化:以牛肉膏和酵母膏作為生長因子的來源,總濃度為0.6%,分別以牛肉膏和蛋白胨之間不同比例(6∶0、5∶1、4∶2、3∶3、2∶4、1∶5、0∶6),進行檸檬酸發酵,以確定最佳無機氮源。

1.2.3.2 Plackea-Burman(簡稱PB)實驗設計優化發酵培養基 根據發酵培養基單因素實驗,影響黑曲霉XSY0607發酵生產檸檬酸的培養基因素包括:水稻秸稈粉、蛋白胨、牛肉膏、NH4NO3、KH2PO4、MgSO4和FeSO4·7H2O。實驗選用10因素2水平的PB實驗設計,對這7個因素進行實驗研究,另外3個因素作為虛擬變量,用于評估誤差。實驗設計的每個因素取2個水平,根據單因素實驗確定的水平,同時根據常規PB實驗設計要求高水平約取低水平的1.5倍。實驗設計和數據分析采用SAS軟件分析,每組做3個重復,結果取平均值。

2 結果與分析

2.1 培養基單因素實驗

2.1.1 碳源對檸檬酸發酵的影響 由于纖維素酶是誘導酶,所以采用了五種天然的纖維素作為碳源。一可以誘導纖維素酶的產生,二可以解決發酵成本過高問題,三可以嘗試為檸檬酸發酵開辟更廣的原料來源。從圖1可以看出:五種纖維素原料作為碳源,水稻秸稈產酸能力最強,其次是玉米秸稈,產酸能力最差的是木屑,可能是木屑中含有大量的木質素的原因。通過方差分析,水稻秸稈對檸檬酸的發酵影響極顯著。所以,黑曲霉XSY0607發酵生產檸檬素最好的碳源是水稻秸稈。

圖1 碳源對產酸的影響Fig.1 Effect of carbon source on production

2.1.2 有機氮源對檸檬酸發酵的影響 從圖2可以看出:五種氮源對檸檬酸的產量的影響不同,蛋白胨對黑曲霉XSY0607菌株產酸能力影響最大,其次是尿素,再次是玉米漿,最后是黃豆餅粉。通過方差分析,蛋白胨對檸檬酸的發酵影響顯著。所以,黑曲霉XSY0607發酵生產檸檬素最好的有機氮源是蛋白胨。

圖2 有機氮源對產酸的影響Fig.2 Influence of organic nitrogen source on acid-producing

2.1.3 無機氮源對檸檬酸發酵的影響 從圖3可以看出:以NH4NO3為無機氮源時,檸檬酸產量最高。通過方差分析,NH4NO3對檸檬酸的發酵影響極顯著。所以,黑曲霉XSY0607發酵生產檸檬素最好的無機氮源氮源是NH4NO3。

表1 N=12的Plackett-Burman實驗設計方案及實驗響應值Table 1 Design and test the response value N=12 Plackett-Burman

圖3 無機氮源對產酸的影響Fig.3 Effects of inorganic nitrogen sources on acid-producing

2.1.4 生長因子對檸檬酸發酵的影響 七種生長因子對檸檬酸發酵結果如圖4所示。

圖4 生長因子對產酸的影響Fig.4 Effect of growth factors on the acid production

從圖4可以看出:牛肉膏和蛋白胨的比例不同,黑曲霉XSY0607發酵產生檸檬酸的產量差別很大,當牛肉膏∶蛋白胨為6∶0時,檸檬酸產量最大,而當牛肉膏∶蛋白胨為0∶6時,檸檬酸產生量很小。通過方差分析,0.6%的牛肉膏對檸檬酸的發酵影響顯著。所以0.6%的牛肉膏是最佳生長因子。

2.2 Plackett-Burman實驗設計優化發酵培養基

應用二水平的Plackett-Burman(簡稱PB)實驗設計對發酵培養基各個組成成分:水稻秸稈粉、蛋白胨、NH4NO3、牛肉膏、MgSO4、KH2PO4和FeSO4·7H2O進行優化,確定發酵培養基各組成成分的濃度。本實驗選取N=12的10因素2水平的PB實驗設計方法,實驗設計及結果見表1、表2和圖5,其中X4、X7、X9為空白項,用于檢驗實驗誤差。根據常規Plackett-Burman實驗設計要求高水平是低水平的1.5倍。

從表2可以看出:通過極差分析RX1>RX2>RX3>RX6>RX8>RX10>RX5,因此黑曲霉XSY0607發酵培養基中不同成分對檸檬酸發酵的影響順序為水稻秸稈>蛋白胨>NH4NO3>KH2PO4>MgSO4>FeSO4·7H2O>牛肉膏。

表2 Plackett-Burman實驗設計因素水平及顯著性Table 2 Experimental design factors and their Plackett-Burman significance

從表2和圖5可以看出:發酵培養基的組分中水稻秸稈粉、蛋白胨、牛肉膏、MgSO4和FeSO4·7H2O表現為正效應,而NH4NO3和KH2PO4表現為負效應。把每個成分的高點組合在一起就組成了黑曲霉XSY0607發酵培養基的最佳配方(%):水稻秸稈粉 6%、蛋白胨 4.5%、NH4NO30.5%、牛肉膏 0.75%、KH2PO40.15%、MgSO40.045%和FeSO4·7H2O 0.0015%。

圖5 培養基各組分不同水平對發酵的影響Fig.5 Influence of components of different levels on the fermentation medium

對優化后的檸檬酸發酵培養基進行檸檬酸生產實驗,做三個平行,所得的檸檬酸產量為83.6mg/mL,比初始的發酵培養基檸檬酸產量提高了31.83%。

3 結論

通過單因素實驗得出黑曲霉XSY0607發酵檸檬酸的最佳碳源為水稻秸稈、最佳有機氮源為蛋白胨、最佳無機氮源為NH4NO3、最佳生長因子為牛肉膏。通過Plackett-Burman實驗設計得到黑曲霉XSY0607發酵檸檬素的最佳培養基配方為:水稻秸稈粉 6%、蛋白胨 4.5%、NH4NO30.5%、牛肉膏 0.75%、KH2PO40.15%、MgSO40.045%和FeSO4·7H2O 0.0015%。同時還可得出黑曲霉XSY0607發酵培養基中不同成分對檸檬酸發酵的影響順序為水稻秸稈>蛋白胨>NH4NO3>KH2PO4>MgSO4>FeSO4·7H2O>牛肉膏。使用優化后的發酵培養基進行檸檬酸發酵實驗,檸檬酸產量達到83.6mg/mL,比用初始發酵培養基發酵檸檬酸產量提高了31.83%。

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Study on the fermentation medium optimization based on cellulose as raw material to produce citric acid byAspergillusnigerSY0607

SUN Ke1,ZHOU Feng-Xia2

(1.Department of Bioengineering,Xuzhou Engineering Vocational and Technical College,Xuzhou 221006,China;2.Xuzhou at the Central Agricultural Broadcasting School,Xuzhou 221000,China)

An optimal process about citric acid deep submerged fermentation withAspergillusnigerXSY0607 was gained as follows:the optimal culture medium was consisted with rice straw,peptone,NH4NO3and beef extract as carbon source,organic,inorganic nitrogen source and growth factor,respectively. Plackett-Burman design was applied for final culture medium of citric acid deep submerged fermentation,and the ratio of the recipe,which was consisted by rice straw,peptone,NH4NO3,beef extract,KH2PO4,KH2PO4and FeSO4·7H2O,was 6%,4.5%,0.5%,0.75%,0.15%,0.045% and 0.0015%,respectively. Range analysis showed the influence of the components to the citric acid fermentation. As a result,the effect for the fermentation,from strong to weak was rice straw,peptone,NH4NO3,KH2PO4,MgSO4,FeSO4·7H2O and beef extract. Medium was optimized using citric acid fermentation tests conducted,citric acid production was 83.6mg/mL,increasing 31.83% compared with level before optimization.

Aspergillusniger;rice straw;submerged fermentation;medium optimization

2014-07-23

孫科(1977-)，男，本科，講師，主要從事生物發酵研究。

徐州生物工程職業技術學院2013年立項課題(2013B07)。

TS201.3

A

1002-0306(2015)11-0172-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.11.026