聚乙二醇/硫酸銨雙水相體系萃取大豆脂肪氧合酶的研究

丁文武,叢林娜,孟 麗,夏云空

(1.西華大學,生物工程學院,四川成都 610039;2.中國科學院上海高等研究院,低碳轉化科學與工程重點實驗室,上海 201210;3.山東勝通集團股份有限公司,山東東營 257500;4.四川大學,生命科學學院,四川成都 610065)

聚乙二醇/硫酸銨雙水相體系萃取大豆脂肪氧合酶的研究

丁文武1,叢林娜2,孟 麗3,夏云空4

(1.西華大學,生物工程學院,四川成都 610039;2.中國科學院上海高等研究院,低碳轉化科學與工程重點實驗室,上海 201210;3.山東勝通集團股份有限公司,山東東營 257500;4.四川大學,生命科學學院,四川成都 610065)

采用聚乙二醇(PEG)/硫酸銨[(NH4)2SO4]雙水相體系對大豆中脂肪氧合酶進行分離萃取研究;通過綜合考察酶分配系數、相比和回收率,探討了(NH4)2SO4、PEG2000、NaCl濃度以及pH對脂肪氧合酶萃取的影響,并通過正交實驗進一步優化實驗條件,結果表明在單一因素下的最佳工藝條件為:(NH4)2SO415%(wt%)、PEG2000 13%(wt%)、NaCl 1%(wt%)、pH5.8;正交實驗優選出的最佳工藝條件為:(NH4)2SO417%(wt%)、PEG2000 13%(wt%)、pH5.2,可獲得酶的分配系數最高可達9.710,萃取率為87.6%。

脂肪氧合酶,雙水相萃取系統,聚乙二醇,硫酸銨

脂肪氧合酶簡稱脂氧酶(lipoxygenase,LOX),屬氧化還原酶。1947年Theorell等首次從大豆中提取脂肪氧合酶的結晶,相對分子量為10.2萬,等電點范圍為5.7～6.2[1]。許多研究結果表明脂肪氧合酶在植物生理,如植物萌發、生長、發育、衰老和抗性等物質轉化中起某種重要調節作用,可以運用于植物抗病、抗蟲和傷害反應,以及含有類胡蘿卜素的植物或海洋食品物質的漂白等,因而是一種非常重要的酶[2]。

雙水相萃取(ATPS)技術是近些年來發展起來的物質分離工藝,與傳統分離方法相比,ATPS具有條件溫和、產品活性損失小、分離步驟少、無有機溶劑殘留、操作簡單等優點[3-4],因而許多研究者以雙水相法對多種生物酶進行了萃取研究,并取得了很多非常有意義的研究成果[5-8]。

本文采用PEG/(NH4)2SO4雙水相體系,系統研究了影響脂肪氧合酶萃取的各個因素,對脂肪氧合酶在該體系中的分配行為進行初步研究,并確定最佳工藝條件,為脂肪氧合酶分離及擴大應用提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料和儀器

大豆 濟南大潤發歷下店;PEG2000,分析純;亞油酸 分析純;氯化鈉,分析純 國藥集團化學試劑有限公司;硫酸銨,分析純 天津市廣成化學實際有限公司;無水乙醇,分析純;石油醚,分析純 天津市富宇精細化工有限公司;吐溫20,化學純 天津市科密歐化學試劑有限公司。

酸度計 上海般特儀器制造有限公司;電熱恒溫水浴鍋 上海森信儀器有限公司;雙光束紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司。

1.2 實驗方法

脫脂豆粉的制備:大豆經攪拌器打碎,用40目標準檢驗篩去皮,稱取200g大豆粉,用石油醚[固液比為m(g)∶v(mL)=1∶5]浸泡5次,每次浸泡3h,干燥后4℃下儲存備用[9]。

水浸提法制備大豆粗酶液:把脫脂豆粉70g,加水350g,攪拌1h(室溫20℃),4000r/min條件下離心20min,取上清液即為粗酶液,4℃下儲存備用。

1.2.1 酶活測定 底物溶液的配制:將0.25mL的吐溫20分散于10mL pH9.0的硼酸鹽緩沖溶液中,搖動下逐滴加入0.27mL亞油酸,充分混合,再加入1mol/L的NaOH溶液,使體系澄清,用1mol/L的HCl溶液調pH為9.0,然后定容到500mL,保存備用[9-10]。

酶活測定:25℃下,在1min內反應體系在波長為234nm處的吸光度增加0.001作為一個酶活單位[9]。取0.2mL粗酶液加到1.5mL的底物溶液中,混勻后于25℃恒溫水浴鍋中反應3min,用5mL無水乙醇終止反應后加入5mL蒸餾水,混勻后用吸光光度計在波長234nm處測定反應液的吸光度。空白實驗為加入粗酶液和無水乙醇后,再加入底物溶液,同樣條件下測定吸光度[9]。

1.2.2 雙水相系統相圖制作 精確稱取40%(wt%,以下同)PEG2000溶液5.0g于試管中,不斷滴加已配好的30%(NH4)2SO4溶液,震蕩混合并觀察其澄清度,直至出現渾濁為止,同時記錄(NH4)2SO4溶液的加入量(g),然后加入少量的水,使其澄清,再繼續向體系中滴加(NH4)2SO4溶液,使其再次達到渾濁并記錄(NH4)2SO4溶液的加入量,如此反復操作,計算每次達到渾濁時,PEG2000和(NH4)2SO4在系統總量中的濃度(wt%),以PEG2000濃度為縱坐標,(NH4)2SO4濃度為橫坐標作圖,即得到一條雙節線的相圖。

有關計算公式:相比R=Vt/Vb,其中:Vt-上相體積(mL),Vb-下相體積(mL);

分配系數Ke=上相酶活/下相酶活;

萃取率Ye(%)=RKe/(1+RKe)×100。

1.2.3 雙水相提取脂肪氧合酶優化工藝研究 以單因素實驗得到的影響因素作為參考,再用正交實驗對雙水相提取大豆中脂肪氧合酶的研究進行優化。選擇PEG2000的濃度、(NH4)2SO4的濃度、pH水平因素,如表1所示,進行正交實驗并分析。

表1 正交實驗水平因素表Table 1 Factors and levels of orthogonal test

2 結果與討論

2.1 雙水相體系相圖

親水性高聚物PEG和(NH4)2SO4在水中之所以能夠形成兩相,是由于高聚物的不相溶性或鹽析作用造成的,但只有這兩種物質在水中達到一定濃度時才能形成兩相[11]。雙水相形成的條件和定量關系可用相圖表示,只有當成相組分的配比在曲線的上方時,才能自動分為兩相。在PEG2000濃度為40%,測定PEG/(NH4)2SO4雙水相體系相圖,結果見圖1。

圖1 PEG/(NH4)2SO4雙水相體系相圖Fig.1 The phase diagram of PEG/(NH4)2SO4 system

2.2 (NH4)2SO4濃度對萃取的影響

2.3 PEG2000濃度對萃取的影響

PEG2000濃度對脂肪氧合酶萃取的影響如表3所示。當(NH4)2SO4固定為15%時,隨著PEG濃度的增加,R、Ke和Ye均先增大后減少。究其原因,當(NH4)2SO4濃度一定時,增大PEG用量,會使體系中成相物質的總濃度增加,同時使萃取相的極性減小,但由于脂肪氧合酶是具有部分極性的非極性物質,因此其在萃取相中的溶解度也將增加,從而使Ke和R不斷增大[14],但是PEG2000濃度太高,會使萃取相的極性降低太多,進而使具有強極性的(NH4)2SO4的溶解度降低而增加了體系黏度,阻止了相間分子轉移,從而在兩相之間形成乳化層,使下相中的酶滯留在兩相之間,反而導致了Ke和Ye的降低。因此PEG2000濃度最佳為13.0%。

表2 (NH4)2SO4濃度對脂肪氧合酶萃取的影響Table 2 Effect of (NH4)2SO4 concentration on lipoxygenase extraction

表3 PEG2000濃度對脂肪氧合酶萃取的影響Table 3 PEG2000 concentration on lipoxygenase extraction

2.4 NaCl濃度對萃取的影響

實驗通過加入不同質量分數的NaCl考察無機鹽對雙水相體系分配行為的影響,結果如表4所示。由表中可以看出,在PEG2000為13%、(NH4)2SO4為15%的條件下,隨著NaCl濃度增加,Ke呈現出減小的趨勢,而Ye和R卻呈現先增加后減小的趨勢。這是由于在PEG/(NH4)2SO4雙水相體系中加入電解質,其陰陽離子在兩相間會有不同的分配,形成相間電勢差,而且鹽分的加入可以加快其分相速度[15],因此隨著NaCl濃度的增加,萃取相的極性也隨之增強,從而使脂肪氧合酶的溶解度下降,Ke呈現出減小的趨勢[15],因此在本實驗當中確定NaCl濃度最佳為1.0%。

表4 NaCl濃度對脂肪氧合酶萃取的影響Table 4 NaCl concentration on lipoxygenase extraction

2.5 pH對萃取的影響

據報道,體系pH與蛋白質的等電點相差越大,蛋白質在兩相中分配越不均勻,pH的微小變化甚至可能使蛋白質分子的分配系數改變2～3個數量級[16]。本文體系pH的變化對脂肪氧合酶萃取的影響如表5所示。從表可知,隨著體系pH的增加,各參數都呈現出先增大后減小的趨勢,當pH為5.8時,Ke和Ye均達到最大值,因而確定萃取的最佳pH為5.8。

表5 pH對脂肪氧合酶萃取的影響Table 5 pH concentration on lipoxygenase extraction

2.6 正交實驗

由表6所示的實驗結果可知,影響萃取效果的主次因素為:(NH4)2SO4濃度>pH>PEG2000濃度,最優條件為A3B3C1,即在(NH4)2SO4質量濃度為17%、PEG(wt%)為15%,pH為5.2的條件下,Ke達到最大,因該組合條件不在9個正交實驗組合中,故在最優實驗組合條件下進行分離萃取,所得Ke值為9.312,Ye值為89.5%。表6中的8號實驗結果雖然比最優實驗結果高4.1%,但是兩者相差不大,可以認為是在誤差范圍內,因而,通過正交實驗得到的最佳實驗條件是合理的;而另一方面,8號實驗的PEG2000 添加量比最優實驗的添加量少,因此,從經濟因素考量,可以將8號實驗條件作為作為最佳實驗條件,即(NH4)2SO417%、PEG2000 13%、pH5.2,此條件下獲得酶的分配系數為9.710,萃取率為87.6%。

表6 正交實驗結果與分析Table 6 Results and analysis of orthogonal test

3 結論

本文采用聚乙二醇(PEG)/硫酸銨[(NH4)2SO4]雙水相體系對大豆中脂肪氧合酶的萃取分離進行了研究。綜合考察酶分配系數、相比和萃取率,探討了(NH4)2SO4、PEG2000、NaCl濃度以及pH對脂肪氧合酶萃取的影響,并通過正交實驗進一步優化實驗條件,結果表明,單一因素下的最佳工藝條件為:(NH4)2SO415%、PEG2000 13%、NaCl 1.0%、pH5.8;正交實驗和驗證實驗優選出的最佳工藝條件為:(NH4)2SO417%、PEG2000 13%、pH5.2,此條件下獲得酶的分配系數為9.710,萃取率為87.6%。

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Extraction of soybean lipoxygenase by PEG/(NH4)2SO4aqueous Two-phase systems

DING Wen-wu1,CONG Lin-na2,MENG Li3,XIA Yun-kong4

(1.School of Bioengineering,Xihua University,Chengdu 610039,China;2.Shanghai Advanced Research Institute,Chinese Academy of Sciences,Shanghai 201210,China;3.Shan Dong Sntion Group Co. Ltd.,Dongying,Dongying 257500,China;4.College of life Science,Sichuan University,Chengdu 610065 ,China)

Separation of lipoxygenase directly from nonfat soybean in aqueous two-phase systems(ATPS)of polyethylene glycol/ammonium sulfate was studied. The effects of polyethylene glycol 2000(PEG2000)concentration,(NH4)2SO4concentration,NaCl concentration,and pH value on the extraction of soybean lipoxygenase were investigated in terms of partition coefficients,phase volume of both enzyme activity and recovery. Orthogonal experiment was used to further analyze and optimize the separation of lipoxygenase. The results indicated that the optimum separation conditions of single factor conditions were PEG2000 13%,(NH4)2SO415%,NaCl 1% and pH5.8. Maximum distribution coefficient and yield of lipoxygenase was 9.710 and 87.6% under the optimum separation conditions of PEG2000 13% ,(NH4)2SO417% and pH5.2 obtained by orthogonal experiment.

lipoxygenase;aqueous two-phase system;PEG;(NH4)2SO4

2014-08-21

丁文武(1980-),男,博士,講師,主要從事生物質提取工作方面的研究。

西華大學2014年校重點科研基金項目(z1420523)；四川省教育廳一般項目(15ZB0126)。

TS201.1

B

1002-0306(2015)11-0210-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.11.034