鹿茸和大豆蛋白酶解物3ku超濾組分的制備及其對小鼠脾細胞增殖影響的研究

趙 磊，王 旋,謝嶠菲,李思然,吳 迪,倪昌征

(北京工商大學北京市食品添加劑工程技術研究中心,食品質量與安全北京實驗室,北京 100048)

鹿茸和大豆蛋白酶解物3ku超濾組分的制備及其對小鼠脾細胞增殖影響的研究

趙 磊，王 旋,謝嶠菲,李思然,吳 迪,倪昌征

(北京工商大學北京市食品添加劑工程技術研究中心,食品質量與安全北京實驗室,北京 100048)

以鹿茸水溶性蛋白和大豆分離蛋白為原料,采用模擬胃腸消化和堿性蛋白酶水解,根據游離氨基含量變化優化水解時間,制備鹿茸蛋白和大豆分離蛋白酶解物。通過超濾分離獲得各酶解物分子量<3ku的組分:鹿茸蛋白模擬胃腸消化物組分(VAWP-SGD)、鹿茸蛋白堿性蛋白酶解物組分(VAWP-APH)、大豆分離蛋白模擬胃腸消化物組分(SPI-SGD)、大豆分離蛋白堿性蛋白酶解物組分(SPI-APH),探究各組分對小鼠脾淋巴細胞增殖的影響。結果表明:模擬胃腸消化時間為胃蛋白酶2h+胰酶5h;堿性蛋白酶水解時間4h。在無誘導劑時,VAWP-SGD和SPI-SGD對小鼠脾細胞增殖均有顯著促進作用(≥100μg/mL)。VAWP-SGD對ConA誘導的小鼠脾T細胞增殖促進作用最顯著,其次是VAWP-APH,SPI-APH無明顯作用,SPI-SGD對脾細胞增殖有輕微抑制作用。VAWP-SGD對LPS誘導的小鼠脾B細胞增殖促進作用最強,其次是VAWP-APH,SPI-APH及SPI-SGD。綜上,VAWP-SGD對小鼠脾細胞增殖影響最大,對進一步開發鹿茸產品和免疫活性肽具有重要意義。

鹿茸水溶性蛋白,大豆分離蛋白,體外模擬胃腸消化,堿性蛋白酶,小鼠脾細胞

亞健康狀態越來越引起人們的關注,其表現多種多樣,最本質、最核心的問題是人體自身免疫功能失調[1]。通過免疫調節改善自身免疫狀況,是人們遠離亞健康的最理想方法。免疫活性肽因其安全、易吸收、用量少、生物活性高的優勢越來越具有研究及市場價值,其可通過促進免疫細胞增殖、提高巨噬細胞活性、促進細胞因子生成等[2-3]來提高機體免疫力。鹿茸作為中華養生五大圣品之一,其蛋白含量豐富,占干重的52%以上[4]。近年來研究發現鹿茸蛋白具有免疫調節、抗腫瘤、抗炎、治療神經損傷等多種生物學效應[5-8],但就鹿茸蛋白被分解成何種小分子肽從而發揮功能活性仍未見報道。大豆肽有降低血清膽固醇、降血壓、增加免疫和促進脂肪代謝等多種生物活性[9-10]。有研究發現蘊藏于蛋白質多肽鏈中的肽類物質的生理活性往往更強于其母體蛋白[11],為了更高效的利用鹿茸水溶性蛋白和大豆蛋白挖掘免疫活性肽,對鹿茸水溶性蛋白和大豆蛋白不同酶解物的免疫調節活性的研究顯得尤為重要。

本研究確定了制備鹿茸水溶性蛋白和大豆分離蛋白模擬胃腸消化物及堿性蛋白酶解物的最佳水解時間,研究了這幾種蛋白酶解物中分子量<3ku肽段對小鼠脾淋巴細胞增殖的影響,對其免疫調節作用進行初步評價。旨在探討和比較不同來源和不同蛋白酶作用獲得多肽的免疫調節活性,為利用鹿茸和大豆制備免疫活性肽提供理論基礎和實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鮮馬鹿茸 由大興安嶺區科技局提供;大豆分離蛋白 北京奧博星生物技術有限公司;SPF級Balb/c小鼠(合格證號:SCXK(京)2012-0001),6～8周齡,雌性 北京維通利華實驗動物技術有限公司;胃蛋白酶,胰酶 美國Sigma化學公司;堿性蛋白酶 丹麥諾維信公司;刀豆蛋白A(ConA)、脂多糖(LPS) 美國MP Biomedical公司;RPMI-1640高糖培養基 美國Gibico公司;青鏈霉素混合液、紅細胞裂解液、CCK-8試劑盒、Hepes 碧云天生物技術研究所;胎牛血清 杭州四季青生物工程材料有限公司;5、10ku超濾膜包 美國Millipore公司;3ku超濾離心管 德國Sartorius公司;其他試劑均為國產分析純。

FD-1B-80型冷凍干燥機 南京普森儀器;TGL-10C型高速臺式離心機 上海智城分析儀器制造有限公司;WE-1水浴恒溫振蕩器 天津市歐諾儀器儀表有限公司;UV-2450型紫外可見光分光光度計 日本島津;XX80EL005可調速超濾儀 美國Millipore公司;Axiovert 200型倒置顯微鏡 德國Zeiss公司;Eclipse Ci-L熒光顯微鏡 日本Nikon公司;Galaxy S型CO2培養箱 英國RS Biotech公司;SpectraMax i3型多功能酶標儀 美國Molecular Devices公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 鹿茸水溶性蛋白的制備 取新鮮馬鹿茸經冷凍干燥后低溫粉碎制成鹿茸粉末。采用文獻[12]報道方法提取鹿茸水溶性蛋白,經梯度鹽析、透析、冷凍干燥得蛋白凍干粉,經計算水溶性蛋白得率為25.5%。蛋白凍干粉于-20℃保存備用。

1.2.2 不同蛋白酶解物的制備和分離 根據酶解過程中游離氨基含量變化優化酶解時間,確定反應條件后制備不同蛋白酶解物。

1.2.2.1 模擬胃腸消化蛋白時間的確定 在底物蛋白濃度為25mg/mL、胃蛋白酶4%(w/v)、pH1.5條件下反應3h,之后添加胰酶4%(w/v)、pH7.0條件下繼續水解8h。每小時取樣測游離氨基含量變化優化酶解時間。

1.2.2.2 堿性蛋白酶水解蛋白時間的確定 在底物蛋白濃度為30mg/mL、堿性蛋白酶質量分數為2%、pH9.5條件下水解10h。每小時取樣檢測游離氨基含量變化優化酶解時間。

1.2.2.3 游離氨基含量的測定 采用茚三酮法[13]測定不同蛋白酶解物中的游離氨基含量。以亮氨酸Leu為標準品繪制標準曲線,標準方程為y=3.7459x+0.022,R2=0.9933。利用標準曲線方程計算酶解液中-NH2含量(mmol/g)。

1.2.2.4 蛋白酶解物的分離 選用截留分子量為10、5ku的超濾膜包和3ku的超濾離心管將蛋白酶解物超濾,獲得各組分經冷凍干燥后4℃保存備用。

1.2.3 脾淋巴細胞增殖實驗

1.2.3.1 小鼠脾細胞懸液的制備 參考文獻[14]，將Balb/c小鼠拉頸處死,無菌分離完整脾臟,用PBS沖去浮血,剝除結締組織及脂肪成分。將脾臟置于小燒杯上的200目不銹鋼濾網上,剪碎并用注射器針芯研磨。用PBS液洗滌,用吸管收集細胞液至離心管,1000r/min離心5min,棄上清液,加入3mL紅細胞裂解液,靜置2min,加入10mL PBS終止反應,1200r/min離心5min,棄上清液。用PBS液洗兩次,不完全RPMI-1640洗一次,加適量RPMI-1640完全培養基(含10%胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素、10mmol/L Hepes)重懸細胞。調整濃度至2×106個細胞/mL。

1.2.3.2 脾淋巴T細胞增殖實驗 將上述脾細胞懸液按100μL/孔加入到96孔培養板中,正常對照組為脾細胞懸液,ConA對照組為含有ConA(終濃度為5μg/mL)的脾細胞懸液,樣品對照組為含有不同濃度樣品的脾細胞懸液,樣品組為含有含有ConA(終濃度為5μg/mL)和不同濃度樣品的脾細胞懸液;隨后用PBS補足使各組終體積為120μL。每個處理設6個復孔,然后將培養板置于37℃、5% CO2的培養箱中培養72h。

1.2.3.3 脾淋巴B細胞增殖實驗 方法同1.2.3.2,將誘導劑ConA換作LPS(終濃度為10μg/mL)。

1.2.3.4 細胞增殖程度的測定及計算分析 本實驗選用CCK-8試劑盒測定細胞增殖程度。結果用刺激指數(Simulation index,SI)表示,公式如下:

1.2.4 統計分析 每個實驗重復6次,數據采用SPSS18.0軟件分析,結果以均值±標準偏差(Mean±SD)表示,組間數據比較用單因素方差分析,p<0.05表示差異顯著,p<0.01表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1.1 模擬胃腸消化過程中游離氨基含量變化 蛋白質在消化過程中被蛋白酶作用分解成不同分子量的肽段和氨基酸,隨時間的延長酶解產物分子量變小,蛋白酶作用位點逐漸減少,酶解體系成分趨于穩定游離氨基含量不再變化。鹿茸蛋白和大豆分離蛋白在模擬胃腸消化過程中游離氨基含量變化如圖1所示。由圖可知游離氨基含量在胃蛋白酶作用下變化較小,進入胰酶作用階段迅速增加隨時間延長趨于穩定,兩種蛋白在消化過程中游離氨基含量的變化趨勢相似。鹿茸水溶性蛋白游離氨基含量的變化在胃消化2h后達到穩定狀態,且含量增加較少。而在進入腸消化階段的1h內迅速由(0.91±0.05)mmol/g增加至(1.71±0.02)mmol/g。繼續腸消化游離氨基含量持續增加,在消化5h后達到最大值(2.63±0.04)mmol/g,之后游離氨基含量保持穩定。大豆分離蛋白在胃消化2h后游離氨基含量達到穩定值(0.79±0.02)mmol/g,進入腸消化階段游離氨基含量迅速增加,在消化5h后達到最大值(3.83±0.05)mmol/g,之后再無顯著變化。游離氨基含量達到穩定值,則蛋白水解充分酶解體系成分趨于穩定,由此確定鹿茸水溶性蛋白和大豆分離蛋白模擬胃腸消化的時間為胃蛋白酶2h+胰酶5h。

圖1 模擬胃腸消化過程中鹿茸水溶性蛋白 和大豆分離蛋白游離氨基含量的變化Fig.1 Changes in the content of α-NH2during simulated gastrointestinal digestion of VAWP and SPI

2.1.2 堿性蛋白酶水解過程中游離氨基含量變化 鹿茸水溶性蛋白和大豆分離蛋白在堿性蛋白酶酶解過程中游離氨基含量變化如圖2所示。由圖看出,兩種蛋白游離氨基含量變化趨勢相近,在酶解初期含量迅速增加,而隨水解時間的延長趨于穩定。加入堿性蛋白酶1h后,鹿茸蛋白游離氨基含量顯著提高(p<0.01)。反應3h后游離氨基含量達到最大值(0.84±0.01)mmol/g,比水解前提高了2.5倍,之后無顯著變化,則鹿茸水溶性蛋白酶解完全時間為3h。大豆分離蛋白在酶解4h后游離氨基含量達到最大值(1.09±0.06)mmol/g,之后游離氨基含量保持穩定,由此推斷大豆分離蛋白在酶解4h后水解充分,酶解物組成成分趨于穩定。為防止大量制備酶解物時蛋白水解不完全,兩種蛋白均采用4h作為水解時間。

圖2 堿性蛋白酶水解過程中鹿茸水溶性蛋白 和大豆分離蛋白游離氨基含量的變化Fig.2 Changes in the content of α-NH2during alkaline protease hydrolysis of VAWP and SPI

綜合圖1和圖2可知,與堿性蛋白酶水解過程相比,鹿茸水溶性蛋白和大豆分離蛋白在模擬胃腸消化環境下游離氨基含量變化更大,水解度更高,由此推測酶解物中小分子量肽段所占百分比可能較高,而且小分子肽更易被吸收利用,此結果暗示著鹿茸蛋白和大豆蛋白的模擬胃腸消化物更易被吸收利用。

2.1.3 超濾分離不同蛋白酶解物 采用超濾技術分離制備分子量<3ku的組分,分別得到鹿茸蛋白模擬胃腸消化物組分(VAWP-SGD)、鹿茸蛋白堿性蛋白酶酶解物組分(VAWP-APH)、大豆分離蛋白模擬胃腸消化物組分(SPI-SGD)和大豆分離蛋白堿性蛋白酶酶解物組分(SPI-APH),各組分占總酶解物的百分比如表1所示。由表1看出,不同蛋白酶解物中分子量<3ku的組分百分含量不同,其中最高的是源自大豆分離蛋白模擬胃腸消化物的SPI-SGD,其次是鹿茸水溶性蛋白模擬胃腸消化物VAWP-SGD,而源自堿性蛋白酶解物的VAWP-APH和SPI-APH含量相對較低。顯然,模擬胃腸消化物中分子量<3ku組分的百分含量比堿性蛋白酶水解物中<3ku組分含量高,這也與其游離氨基含量較高相統一。

表1 不同蛋白酶解物中分子量<3ku的組分含量Table 1 The contents of <3ku ultrafiltration fractions in different hydrolysates

2.2 不同蛋白酶解物分子量<3ku組分對小鼠脾細胞增殖的影響

本研究通過各蛋白酶解物<3ku肽段對小鼠體外脾細胞增殖的影響來評價其免疫調節作用。超濾所得分子量<3ku肽段對小鼠脾細胞增殖活性的影響如圖3～圖5所示。

由圖3可知,當濃度≤1μg/mL時,VAWP-SGD、VAWP-APH、SPI-SGD和SPI-APH單獨對小鼠脾細胞增殖的影響均不顯著(p>0.05)。除VAWP-APH在濃度為10μg/mL時對脾細胞增殖有顯著促進作用(p<0.05)外,兩種堿性蛋白酶解物<3ku組分在研究濃度范圍內無明顯作用。在濃度≥100μg/mL時,VAWP-SGD和SPI-SGD對小鼠脾細胞增殖有顯著促進作用,SI值最高分別達到1.16±0.10和1.16±0.01,與空白對照組相比增長了15.9%(p<0.05)和16.2%(p<0.05)。結果表明,同種蛋白酶作用下鹿茸蛋白源的<3ku組分和大豆蛋白源的<3ku組分對小鼠脾細胞增殖作用類似,其中模擬胃腸消化物組分均有明顯促進作用。而同種蛋白由不同蛋白酶水解得到的酶解物<3ku組分對小鼠脾細胞增殖影響有顯著差異,其中模擬胃腸消化物分離組分有更明顯的促進作用。這可能是因為不同來源的蛋白氨基酸組成有顯著差異,且因蛋白酶對肽鍵的水解專一性,得到了組成和結構迥異的酶解物,從而對細胞增殖產生不同的影響。

圖3 不同蛋白酶解物分子量<3ku組分 對小鼠脾細胞增殖的影響Fig.3 Effect of <3ku ultrafiltration fractions of different protein hydrolysates on the proliferation of murine splenocytes注:*p<0.05,**p<0.01(與對照組比較),圖4、圖5同。

由圖4可知,在濃度為0.5～200μg/mL范圍內VAWP-SGD對ConA誘導的小鼠脾T淋巴細胞增殖有顯著促進作用(p<0.05),其中在濃度為50μg/mL時SI值最高,比對照組增長了18.8%(p<0.01),之后繼續增加樣品濃度SI值開始降低,在400μg/mL時促進作用消失,導致這一結果的原因需進一步研究。VAWP-APH在≥50μg/mL時對脾細胞增殖呈明顯促進作用,在濃度為100μg/mL時SI值達到最高,比對照組增長了12.3%(p<0.01)。SPI-APH對ConA誘導的小鼠脾細胞增殖無顯著影響,而SPI-SGD對ConA誘導的脾細胞增殖呈輕微抑制作用,在濃度為100μg/mL時SI值降低最高達12.0%。ConA是T淋巴細胞的有絲分裂原,可促進T淋巴細胞活化,進而使細胞因子合成、細胞因子受體表達、細胞分化及細胞增殖等變化。機體內T淋巴細胞的數量越大,增殖活性越高,機體由T淋巴細胞介導的細胞免疫功能越強[15]。本研究中VAWP-SGD和VAWP-APH對小鼠脾T細胞增殖在不同程度上均有促進作用,表示其具有免疫調節活性促進細胞免疫應答,其中VAWP-SGD作用更明顯。而SPI-SGD對ConA誘導的脾細胞增殖呈抑制作用,發生該現象的機理有待進一步探討,可能是樣品影響了細胞對ConA的敏感性或是樣品預先結合了細胞上ConA的受體從而使其失去了刺激細胞的作用。

上文例(1)這樣的句子屬于典型的敘事語體句，符合上面列出的要求；而在《駱駝祥子》中的另一段，則屬于非典型的敘事語體句：

圖4 不同蛋白酶解物分子量<3ku組分 對ConA誘導的小鼠脾細胞增殖活性的影響Fig.4 Effect of <3ku ultrafiltration fractions of different protein hydrolysates on ConA-stimulated proliferation of murine splenocytes

LPS是一種非胸腺依賴性抗原,不需要輔助性T淋巴細胞的作用,可直接刺激B淋巴細胞增殖分化為產生抗體的漿細胞,并分泌IgM等抗體,發揮體液免疫的功能[16]。圖5表明,在濃度≥0.5μg/mL時,VAWP-SGD可顯著促進小鼠脾淋巴B細胞增殖,在濃度為100μg/mL時SI值達到最高,比對照組增加17.2%(p<0.01)。而VAWP-APH呈現顯著促進小鼠脾細胞增殖的作用,SI值最高增長11.40%(p<0.01)。SPI-SGD對小鼠脾淋巴B細胞的促進作用隨濃度增大呈先增加后減小的趨勢,在50μg/mL時SI最高達到1.648,增長了9.26%。SPI-APH在濃度為100～400μg/mL時顯著促進細胞增殖(p<0.01),在100μg/mL時最高增長11.26%。由此可見,隨樣品濃度變化,幾種<3ku的肽段組分對小鼠脾淋巴B細胞增殖均有促進作用,但作用趨勢明顯不同,其中VAWP-SGD促進作用最強,其次是VAWP-APH。

圖5 不同蛋白酶解物分子量<3ku組分 對LPS誘導的小鼠脾細胞增殖活性的影響Fig.5 Effect of <3ku ultrafiltration fractions of different protein hydrolysates on LPS-stimulated proliferation of murine splenocytes

上述結果表明,不同蛋白酶解物<3ku組分對脾細胞增殖影響有顯著差異。不同源蛋白的氨基酸組成差異可能是超濾所得肽段影響小鼠脾細胞增殖的主要因素之一。此外,蛋白酶種類也是重要影響因素。蛋白中含有許多生物活性序列,其中包括免疫活性肽,它以無活性的形式存在于蛋白前體物中,只有用適當的蛋白酶水解出來后,才能成為具有生理活性的肽段[17]。免疫活性肽通常含有堿性氨基酸[18],模擬胃腸消化中胃蛋白酶主要水解苯丙氨酸、酪氨酸和亮氨酸組成的肽鍵促進水溶性蛋白質水解成為多肽,胰酶能夠特異性地切斷賴氨酸和精氨酸結合的位點產生富含堿性氨基酸的肽段,暴露出可能具有免疫調節活性的肽段。堿性蛋白酶作為一種非特異性內切酶主要作用于含疏水性羧基的肽鍵,可隨機產生大量的小分子肽段,使蛋白質充分水解[19-22]。總的來說,鹿茸蛋白模擬胃腸消化物中<3ku組分對小鼠脾細胞增殖影響最大,其具有較顯著的免疫調節活性,對繼續開發鹿茸產品和免疫活性肽具有重要意義。

3 結論

本研究主要針對鹿茸水溶性蛋白和大豆分離蛋白,通過模擬胃腸消化和堿性蛋白酶水解獲得不同蛋白酶解物,經超濾分離制備不同蛋白酶解物<3ku組分,采用脾細胞增殖實驗探討各組分免疫調節活性。結果表明,鹿茸水溶性蛋白和大豆分離蛋白模擬胃腸消化的時間為胃蛋白酶2h+胰酶5h,堿性蛋白酶水解時間為4h。經模擬胃腸消化的鹿茸水溶性蛋白和大豆分離蛋白游離氨基含量更高,水解度更大。經超濾分離所得分子量<3ku的各組分對小鼠脾細胞增殖影響差異顯著。其中,鹿茸水溶性蛋白模擬胃腸消化物<3ku組分對未經誘導、ConA和LPS誘導的脾細胞增殖的促進作用最強,具有較強的免疫調節活性。此結果表明蛋白質來源和蛋白酶種類均對酶解物的免疫調節活性有一定影響,而蛋白質種類影響更大。本研究為進一步研究開發鹿茸產品和免疫活性肽提供理論和實驗基礎。鹿茸水溶性蛋白經模擬胃腸消化后釋放出的生物活性肽的氨基酸組成、肽序及其作用機制仍然未知,可為下一步研究提供方向。

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Preparation of 3ku ultrafiltration fractions from velvet antler and soybean protein hydrolysates and their effect on murine splenocytes proliferation

ZHAO Lei,WANG Xuan,XIE Qiao-fei,LI Si-ran,WU Di,NI Chang-zheng

(Beijing Engineering and Technology Research Center of Food Additives/Beijing Laboratory for Food Quality and Safety,Beijing Technology and Business University,Beijing 100048,China)

Velvet antler water-soluble protein(VAWP)and soybean protein isolate(SPI)were hydrolyzed byinvitrosimulated gastrointestinal digestion and Alcalase to obtain different protein hydrolysates. The hydrolysis time was optimized according to the changes in the content of α-NH2. The<3ku fractions of velvet antler water-soluble protein simulated gastrointestinal digest(VAWP-SGD),velvet antler water-soluble protein Alcalase hydrolysate(VAWP-APH),soybean protein isolate simulated gastrointestinal digest(SPI-SGD)and soybean protein isolate Alcalase hydrolysate(SPI-APH)were fractionated by ultrafiltration. The effect of<3ku fractions on the proliferation of murine splenocytes were studied. Results indicated that the hydrolysis time ofinvitrosimulated gastrointestinal digestion were 2h with pepsin and 5h with pancreatin. The hydrolysis time by Alcalase was 4h. VAWP-SGD and SPI-SGD significantly promoted the proliferation of resting murine splenocytes(≥100μg/mL). VAWP-SGD showed the highest stimulated effect on ConA-stimulated murine splenocytes proliferation,followed by VAWP-APH. SPI-APH had no obvious effect on ConA-stimulated murine splenocytes proliferation,whereas SPI-SGD inhibited the proliferation of ConA-stimulated murine splenocytes. VAWP-SGD also had the strongest stimulated effect on LPS-stimulated murine splenocytes proliferation,followed by VAWP-APH,SPI-APH,and then was SPI-SGD. The above results showed that VAWP-SGD had the strongest stimulated effect on the proliferation of murine splenocytes,which suggested that VAWP-SGD was of great significance for the development of antler products and immune active peptide.

VAWP;SPI;invitrosimulated gastrointestinal digestion;Alcalase;murine splenocytes

2014-09-02

趙磊(1982-)，女，博士，副教授，主要從事功能性食品研究。

國家自然科學基金青年科學基金項目(31201324)；大學生科學研究與創業行動計劃項目(SJ201402064)；北京市教育委員會科技計劃面上項目(KM201210011008) 。

TS201.4

A

1002-0306(2015)11-0342-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.11.061