化香蟲茶總黃酮對CCl4誘導小鼠肝損傷的預防效果

王 睿,孫 鵬

(重慶第二師范學院 生物與化學工程系,重慶 400067)

化香蟲茶總黃酮對CCl4誘導小鼠肝損傷的預防效果

王 睿,孫 鵬*

(重慶第二師范學院 生物與化學工程系,重慶 400067)

本文對蟲茶總黃酮的肝損傷預防效果進行了研究。蟲茶黃酮可以使CCl4誘導的肝損傷小鼠血清中的谷草轉氨酶(AST)、谷丙轉氨酶(ALT)、乳酸脫氫酶(LDH)、丙二醛(MDA)和甘油三酯(TG)含量下降,升高血清中的還原型谷胱甘肽(GSH)含量。同時,蟲茶黃酮還可以使肝損傷小鼠肝臟中的MDA和TG含量下降,GSH含量上升,且100mg/kg濃度蟲茶黃酮的效果更顯著,能夠接近常用的肝病治療藥物水飛薊。對小鼠血清中細胞因子的檢測也發現灌胃蟲茶黃酮小鼠的IL-6、IL-1β、TNF-α和IFN-γ水平低于對照組小鼠,接近正常組和藥物水飛薊組。組織病理切片證明蟲茶黃酮可以減輕CCl4對肝組織的破壞,保護肝臟細胞。蟲茶黃酮灌胃小鼠相對于對照組小鼠肝臟組織中的炎癥相關基因NF-κB被下調,IκB-α被上調。結果表明蟲茶黃酮有較好的肝損傷預防效果。

類黃酮,蟲茶,肝損傷,細胞因子,表達

蟲茶是一種制作方法特殊,利用化香夜蛾和化香樹葉生產的茶飲品,主要產于貴州,湖南和四川等省份[1]。由于蟲茶的生產還采用最原始的方法,且產地多集中在少數民族地區,所以產量有限,其生產難以工業化。蟲茶的生產方式特殊,將野生的化香樹葉等植物葉片放入竹簍中,在葉片之間淋上淘米水后將竹簍放置在房梁上待化香夜蛾等昆蟲飛入產卵,幼蟲孵化出后以葉片為食,排出的糞粒去除殘渣后得到蟲糞顆粒,再通過炒制等工藝便生產出蟲茶[2]。蟲茶中含有多種對人體有益的成分,包括大量的氨基酸,茶黃酮,茶多酚和茶多糖[3]。

肝臟是重要的生理器官,發生嚴重損傷后會危及生命,其中由化學性肝毒性物質所造成的化學性肝損傷在肝損傷中是較為常見的,包括酒精、藥物和化學毒性物質都可能造成化學性肝損傷。化學性肝損傷易發生,潛伏期短,且損傷的程度與刺激物劑量有直接關系,損傷可致肝細胞壞死、脂肪變形,嚴重的情況下會引起肝硬化和肝癌。在實驗室條件下通過動物實驗已經證實植物黃酮對包括酒精性肝損傷和四氯化碳引發肝損傷有良好的抑制效果[4-5]。針對蟲茶中含有較多的黃酮類化合物,本研究對貴州少數民族地區產蟲茶中的黃酮提取物進行了動物體內實驗,通過對CCl4誘導急性肝損傷小鼠的血液和肝臟指標的分析對蟲茶黃酮的肝損傷預防效果進行了研究,這些研究結果將推動蟲茶的進一步研究和為蟲茶的推廣提供支持依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蟲茶 貴州產化香蟲茶;實驗動物 購于重慶醫科大學實驗動物中心的清潔級6周齡雄性昆明小鼠(體重(25±5)g,動物許可證:SCXK(渝)2012-0001),飼養條件控制在室溫22±4℃,相對濕度50%±20%。動物購入后正常飼養7d后進行實驗。

AST、ALT、LDH、MDA和TG試劑盒 南京建成生物工程研究所;IL-6、IL-12,TNF-α和IFN-γ酶聯免疫試劑盒 美國Biolegend公司;CycleTESTTM PLUS DNA染色試劑盒 德國Becton Dickinson公司;Trizol試劑、oligodT18、RNase、dNTP 和MLV 美國Invitrogen公司;RT-PCR(反轉錄聚合酶鏈式反應)引物iNOS和COX-2 德國Eppendorf公司;水飛薊素 美國Sigma公司;CCl4誘導劑(CCl4和橄欖油按1∶1比例混合);其余試劑均為國產分析純。

R1002VN旋轉蒸發儀 鄭州長城科工貿有限公司;FD-1E-50冷凍干燥機 重慶邁克科技公司;UV-2550型紫外分光光度計 日本島津公司;TG1650-WS高速離心機 重慶春鑫科技有限公司;BX41顯微鏡 日本奧林巴斯公司;Bio-Rad 680酶標儀、Bio-Rad小型水平電泳槽 美國Bio-Rad公司;ABI 2720 PCR儀 美國Applied Biosystems公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 蟲茶黃酮的提取 蟲茶冷凍干燥后粉碎。采用文獻方法[6],取1kg冷凍干燥的蟲茶粉末,加入10L的70%乙醇溶液,再在70℃水浴下浸提4h,濾液過硅藻土除去脂溶性雜質,收集提取液再通過ADS-17樹脂使黃酮類物質被樹脂吸附,再用90%的乙醇溶液洗脫下樹脂吸附的黃酮物質,最后旋轉蒸發蒸干溶劑得到黃酮提取物。再取蘆丁標準品,溶入90%的乙醇溶液,制成濃度為10、20、30、40和50μg/mL濃度的蘆丁標準液。再將苦丁蟲茶黃酮提取物也溶于90%的乙醇溶液,用分光光度儀在500nm處測定吸光度,根據蘆丁標準品溶液的標準曲線進行對比,計算得蟲茶黃酮提取物中黃酮物質(蘆丁計)的純度。

1.2.2 將實驗用小鼠分為5組:正常組、對照組、50mg/kg蟲茶黃酮組、100mg/kg蟲茶黃酮組和水飛薊藥物組,每組10只。在前14d中,正常組和對照組小鼠每天灌一次胃蒸餾水(0.2mL);50mg/kg蟲茶黃酮組小鼠按濃度50mg/kg(灌胃濃度:小鼠體重每1kg灌胃樣品50mg)灌胃0.2mL的蟲茶黃酮一次;100mg/kg蟲茶黃酮組小鼠按濃度100mg/kg灌胃0.2mL的蟲茶黃酮一次;水飛薊藥物組小鼠按濃度100mg/kg灌胃0.2mL的水飛薊一次。第14d對所有小鼠實施灌胃后按0.2mL/kg對除正常組小鼠外其他小鼠腹腔注射CCl4肝損傷誘導劑,同時對所有小鼠禁食,但允許自由飲水,24h后斷頸處死小鼠,取心臟血離心分離10min(4000r/min),取上層血清待用,同時解剖取肝臟待用[7]。

1.2.3 血清指標測定 各組小鼠血清中AST、ALT、LDH、MDA、GSH和TG含量按試劑盒操作說明書操作測定。

1.2.4 組織指標測定 將各組小鼠肝臟用生理鹽水洗凈加入9倍量生理鹽水后用超聲粉碎機粉碎后制成組織勻漿,組織中MDA、GSH和TG水平和IL-6、IL-1β,TNF-α和IFN-γ細胞因子水平按試劑盒操作說明書操作測定。

1.2.5 肝臟組織病理學觀察 將小鼠肝組織固定在10%的福爾馬林溶液中24h,然后用乙醇脫水,再將肝組織包埋在石蠟中。將石蠟組織切為4μm厚度,用蘇木精和伊紅染色后在顯微鏡下進行組織病理觀察。

1.2.6 RT-PCR法檢測肝組織中炎癥相關基因表達 將小鼠肝臟用超聲粉碎機粉碎后用RNAzol試劑提取肝組織中的RNA。將提取的肝組織RNA濃度稀釋到1μg/μL。在2μL的肝組織RNA提取液中分別加入oligodT18,RNase,dNTP和MLV酶各1μL,5×buffer 10μL,在37℃、120min,99℃、4min,4℃、3min的條件下合成cDNA。然后以反轉錄-聚合酶鏈反應法擴增NF-κB和IκB-α表達,同時以持家基因作為對照內參照。最后將溴化乙錠加入瓊脂中制成含有1%溴化乙錠的瓊脂膠板,采用電泳檢查PCR擴增產物[1]。

1.3 數據統計

對實驗結果以平均值±標準偏差表示后使用SAS統計軟件對所得數據采用one-way ANOVA法分析數據結果在p<0.05水平上是否具有顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 蟲茶黃酮提取物的純度

以蘆丁作為標準品測定植物樣品提取物中總黃酮的含量是檢測提取物總黃酮純度的常用方法。通過測定10～50μg/mL濃度的蘆丁標準液的吸光度,得到總黃酮濃度的蘆丁標準曲線為y=0.001x-0.0054(x為黃酮濃度,y為吸光值,圖1)。通過對照標準曲線可以檢測出蟲茶黃酮提取物中黃酮類物質的含量達到37.2%。

圖1 蘆丁標準液標準曲線Fig.1 Standard curve of rutin standard liquid

2.2 蟲茶黃酮對CCl4誘發肝損傷小鼠血清中AST、ALT和LDH水平的影響

小鼠灌胃蟲茶黃酮14d后,采用CCl4誘導肝損傷,通過檢測小鼠血清中的特定指標可以判斷肝損傷程度。AST、ALT和LDH均是臨床上檢測肝病和肝損傷的重要指標,肝損傷對照組的AST、ALT、AST/ALT和LDH指標均比正常組顯著提高(p<0.05),蟲茶黃酮可以減緩這些指標的升高,而且在100mg/kg濃度蟲茶黃酮灌胃下,減緩得更多,接近水飛薊藥物組(表1)。ALT與AST主要分布在肝臟細胞內,肝細胞出現損傷和壞死時,肝臟中的ALT和AST含量就會升高。同時,因為ALT和AST含量升高的程度與肝細胞受損的程度呈正相關,所以ALT和AST含量是最常用的肝功能檢測指標。ALT和AST可以準確的檢測嚴重的肝疾病(肝硬化、肝纖維化、肝癌),嚴重肝損傷時AST/ALT會大于1,通過AST和ALT的比值可以更好的評價肝損傷[8]。LDH作為糖酵解酶,也可以體現肝臟受損的程度,肝臟出現損傷時,LDH在血清中的含量也明顯升高[7]。本研究發現蟲茶黃酮可以降低肝損傷小鼠血清中的AST、ALT、AST/ALT和LDH水平,100mg/kg的蟲茶黃酮效果略優于藥物水飛薊。通過結果可以看到蟲茶黃酮可以減輕小鼠的肝細胞損傷程度,證明蟲茶黃酮有較好的肝損傷預防效果。

表1 CCl4誘導肝損傷小鼠的血清AST、ALT和LDH水平Table 1 Serum levels of AST,ALT and LDH in mice following CCl4 induced liver injury

注:a-e不同字母表示各組間差異顯著(p<0.05),相同字母表示各組間差異不顯著(p>0.05),表2～表3同。

表2 CCl4誘導肝損傷小鼠的血清和肝組織MDA、GSH和TG水平Table 2 Serum levels and hepatic tissues of MDA,GSH and TG in mice following CCl4 induced liver injury

2.3 蟲茶黃酮對CCl4誘發肝損傷小鼠血清和組織中MDA、GSH和TG含量的影響

由表2可以看出蟲茶黃酮灌胃小鼠血清和組織中的MDA和TG含量較肝損傷對照組顯著降低(p<0.05),且100mg/kg濃度灌胃小鼠的水平低于50mg/kg濃度灌胃小鼠,略高于正常組小鼠。蟲茶黃酮的處理肝組織中的GSH含量較對照組顯著上升(p<0.05)。CCl4作用于肝臟后產生的·CCl3可引起肝細胞膜發生脂質過氧化,導致肝損傷。MDA在血清和組織中的含量可以表示脂質過氧化的程度,用以判斷肝臟受CCl4損害的程度[9]。GSH是重要的抗氧化劑,能過通過與體內有害的毒物的結合將它們排出體外,GSH通過與肝臟中CCl4產生的有害物質結合,將有害物質帶出體外,減輕肝損傷。TG升高代表脂肪酸含量高,脂肪酸含量高與肝病有一定的聯系[10]。有研究表明CCl4引發的肝損傷可引發體內MDA和TG含量升高,GSH含量下降[9]。蟲茶黃酮可以降低小鼠體內MDA、TG含量和增高GSH含量,通過對這些指標的條件作用,蟲茶黃酮可能具有抑制肝臟受CCl4損害造成的肝臟脂質過氧化和加速排除體內由于肝損傷產生毒素的效果,從而起到了肝保護效果。

2.4 蟲茶黃酮對CCl4誘發肝損傷小鼠血清中炎癥細胞因子水平的影響

由表3可知,蟲茶黃酮可以顯著降低肝損傷小鼠血清中的IL-6、IL-1β、TNF-α和IFN-γ水平,100mg/kg濃度灌胃下小鼠的炎癥細胞因子水平比50mg/kg濃度蟲茶黃酮的作用更為強烈,可以更明顯的降低這些炎癥細胞因子水平。肝臟被損傷后經常會出現炎癥,通過檢測炎癥細胞因子的水平可以衡量肝損傷的程度。這些細胞因子在內臟發生損傷的過程中有十分重要的作用,IL-6和TNF-α等細胞因子作為重要的炎癥介質參與機體的炎癥反應,正常生理狀態下,血液中的TNF-α和IL-6水平較低,但在病理狀態下,TNF-α和IL-6含量升高以及引起的其他炎癥因子大量釋放可導致炎癥加劇,這些反應都可以引起肝細胞損傷[7]。IL-6還能使INF-γ增加,INF-γ具有激活非特異性效應細胞的能力,能夠介導細胞免疫的效應過程[11]。有研究表明CCl4誘導小鼠肝損傷會造成小鼠血清中的IL-6、IL-1β、TNF-α和IFN-γ水平顯著高于正常小鼠[7]。可見蟲茶黃酮可以通過顯著(p<0.05)降低肝損傷小鼠體內IL-6、IL-1β、TNF-α和IFN-γ炎癥因子水平,達到緩解炎癥的效果。由于蟲茶黃酮對肝損傷誘發的炎癥的抑制作用,肝損傷的程度則明顯緩解。由此可以判斷蟲茶黃酮是具有很好抗炎和預防肝損傷的功效物質。

表3 CCl4誘導肝損傷小鼠的細胞因子IL-6、IL-1β、TNF-α和IFN-γ水平Table 3 Cytokine levels of IL-6,IL-1β,TNF-α and IFN-γ in mice following CCl4 induced liver injury

2.5 蟲茶黃酮對CCl4誘發肝損傷小鼠肝組織病理狀態的影響

由圖2可知,正常組小鼠肝組織結構清晰,肝小葉邊界完整,無中央靜脈擴張;對照組小鼠的肝臟組織出現大部分肝細胞壞死,肝小葉網狀結構被嚴重破壞,細胞間結構不完整;50mg/kg蟲茶黃酮灌胃小鼠肝臟的肝小葉也出現部分破壞,有一定面積的肝壞死;100mg/kg蟲茶黃酮則很大程度上緩解了CCl4對肝臟組織造成的損害,肝臟受損面積很小,肝小葉結構也比較完整,肝小葉中央無壞死;水飛薊組小鼠由于藥物的作用,肝組織同100mg/kg蟲茶黃酮組小鼠一樣沒有出現大面積的壞死,組織結構較完整。組織病理切片作為臨床上重要的判斷病癥的方法可以對肝損傷進行準確的評價[7],本研究中通過病理切片也確定蟲茶黃酮可以大大減輕CCl4誘發肝損傷對肝細胞造成的損害,起到很好的肝損傷預防作用。

圖2 CCl4誘導小鼠肝損傷肝組織病理圖像(×200)Fig.2 Histological images of the liver tissue of mice with CCl4 induced liver injury(×200)

2.6 蟲茶黃酮對CCl4誘發肝損傷小鼠肝組織中NF-κB和IκB-α的mRNA水平的影響

由圖3可以看出,對于對照組小鼠的肝組織蟲茶黃酮可以下調小鼠肝組織中NF-κB的mRNA表達,并且100mg/kg濃度蟲茶黃酮比50mg/kg蟲茶黃酮下調得更多;同時,蟲茶黃酮也可以上調IκB-α表達。100mg/kg濃度蟲茶黃酮處理后,小鼠肝組織中NF-κB和IκB-α表達與水飛薊處理小鼠相似,接近正常組小鼠。肝損傷發生后會引發肝組織發炎,NF-κB的活化可引起肝臟炎癥,IκB-α是NF-κB的抑制因子,IκB-α釋放減少會引起NF-κB水平上升,兩者在組織中的水平呈負相關[7]。蟲茶黃酮對肝組織中的NF-κB和IκB-α的mRNA表達水平也呈現出這樣的結果,可見蟲茶黃酮可以減輕由于肝損傷造成的炎癥基因表達的增強,從而起到肝損傷預防作用。

圖3 小鼠肝組織NF-κB和IκB-α的mRNA表達水平Fig.3 mRNA expression levels of NF-κB and IκB-α in liver injury of mice

3 結論

本研究采用CCl4建立動物肝損傷模型對蟲茶黃酮進行肝損傷預防作用的實驗。實驗結果顯示蟲茶黃酮可以降低肝損傷小鼠血液中AST、ALT、LDH、MDA和TG含量,增加GSH的含量。同時,蟲茶黃酮也可以降低肝損傷小鼠肝組織中的MDA和TG含量,增加GSH的含量。蟲茶黃酮對血清中炎癥細胞因子的含量也起到了調節作用,相對于對照小鼠,蟲茶黃酮可以降低小鼠的IL-6、IL-1β、TNF-α和IFN-γ水平。通過肝臟組織的病理學觀察發現蟲茶黃酮可以減輕CCl4對肝臟細胞的損害,效果略優于臨床常用肝病治療藥物水飛薊。對肝組織的RT-PCR實驗也發現蟲茶黃酮能下調肝組織中NF-κB的mRNA表達水平,并上調IκB-α表達。由這些結果可以看出蟲茶黃酮作為蟲茶中有效的功能性提取物具有很好的肝保護作用。但是,蟲茶以及蟲茶黃酮對肝臟的保護作用機理還有待進一步的研究。

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Preventive effect of total flavonoids of Platycarya strobilacea insect tea on CCl4induce liver injury in mice

WANG Rui,SUN Peng*

(Department of Biological and Chemical Engineering,Chongqing University of Education,Chongqing 400067,China)

In this study,the liver injury preventive effect of total crude flavonoids of Insect tea(FIT)were determined. FIT could reduce the serum levels of AST,ALT,LDH,MDA,and FIT also could raise GSH level in mice by CCl4induced hepatic injury. After FIT treatment,the MDA,TG levels of liver tissues were decreased,and the GSH level was increased in mice. In addition,the 100mg/kg of FIT showed the stronger effect,and the effect was close to the hepatic drug of silymarin treatment. In serum cytokine level tests,the IL-6,IL-1β,TNF-α and IFN-γ levels of FIT treated mice were lower than liver injury control mice,these levels were close to the normal and silymarin treated mice. It was found that FIT could decrease the injury levels of CCl4induced hepatic tissues and protect the liver cells through the histopathology test. FIT down regulated the expression of NF-κB;and up regulated IκB-α expression in liver tissues of live injury mice compare to the control mice. These results proved that FIT had good preventive effect of liver injury.

flavonoid;insect tea;liver injury;cytokine;expression

2014-08-11

王睿(1982-),男,碩士,講師,研究方向：食品營養和功能性食品。

*通訊作者:孫鵬(1983-),男,碩士,講師,研究方向：天然產物和藥學。

重慶市教委科學技術研究項目(KJ1401402)。

TS201.1

A

1002-0306(2015)11-0361-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.11.065