金雀異黃素對雌激素依賴靶基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)作用

孫瑩 孫肅 孫靜

[摘要] 目的 觀察金雀異黃素（genistein，GNT）對雌激素受體（estrogen receptor，ER）靶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用。 方法 采用不同濃度的金雀異黃素（5、10、20 ng/mL）+雌二醇（10 ng/mL）或雌二醇單獨(dú)處理乳腺癌細(xì)胞MCF7，36 h后收集細(xì)胞檢測金雀異黃素對雌激素反應(yīng)元件（estrogen response element，ERE）報告基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用，通過定量PCR技術(shù)檢測金雀異黃素對ER靶基因PDZK1和GREB1轉(zhuǎn)錄水平的影響。 結(jié)果 隨著金雀異黃素濃度的增高，ER報告基因的轉(zhuǎn)錄水平逐漸下降，與之相一致，PDZK1和GREB1的轉(zhuǎn)錄水平也逐漸下降，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。 結(jié)論 金雀異黃素能夠與雌二醇競爭結(jié)合細(xì)胞表面的ER，并拮抗ER調(diào)控的靶基因表達(dá)。

[關(guān)鍵詞] 金雀異黃素；雌二醇；雌激素受體；轉(zhuǎn)錄調(diào)控

[中圖分類號] R344+.13；R285.5 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2015）02（a）-0012-03

植物中有各種抗炎抗腫瘤作用的活性物質(zhì)[1]，大豆異黃酮是已知的植物雌激素，在預(yù)防和治療腫瘤、心血管疾病、骨質(zhì)疏松癥和絕經(jīng)后綜合征等方面的作用已經(jīng)得到廣泛認(rèn)可[2]。金雀異黃素化學(xué)名為4，5，7-三羥基異黃酮，性狀是淡黃色樹枝狀針晶粉末，熔點(diǎn)（mp）297～298℃，溶于常用的有機(jī)溶劑，幾乎不溶于水，溶于稀堿中呈黃色。金雀異黃素（又稱染料木素）是來源于豆類植物和齒狀植物的異黃酮類化合物，可通過影響一系列的細(xì)胞信號通路，發(fā)揮廣泛的預(yù)防和治療腫瘤作用[3-5]。金雀異黃素是一種強(qiáng)力的酪氨酸蛋白激酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑，通過抑制以上兩種酶的活性，達(dá)到對癌基因的調(diào)控，從而實(shí)現(xiàn)多途徑抑制腫瘤的生長轉(zhuǎn)移[6]。金雀異黃素（Genistein）增加性激素結(jié)合球蛋白合成，從而降低激素生物利用度，降低雌激素依賴細(xì)胞增殖活性，減少激素相關(guān)腫瘤的發(fā)生。但金雀異黃素水溶性很低，直接服用不利于人體吸收[7]，能否降低雌激素的生物利用度，抑制雌激素調(diào)控的靶基因表達(dá)目前還不明確。金雀異黃素抗癌研究已經(jīng)成為全球熱點(diǎn)，并已取得很大進(jìn)展[8]。本文通過報道基因及實(shí)時定量PCR實(shí)驗證實(shí)金雀異黃素能夠和雌二醇競爭乳腺癌細(xì)胞表面的雌激素受體（ER），并抑制ER調(diào)控靶基因的表達(dá)，現(xiàn)將結(jié)果報道如下：

1 材料與方法

1.1 材料

乳腺癌細(xì)胞系MCF7購自北京協(xié)和細(xì)胞庫。雌二醇（純度99%）購自北京四環(huán)制藥廠；金雀異黃素（純度98%）購自Sigma公司；DMEM培養(yǎng)基及Real Mastermix（SYBR Green）購自天根公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Invitrogen公司；Fugene 6轉(zhuǎn)染試劑為Roche Diagnostics公司產(chǎn)品；雙報告基因熒光素酶檢測試劑盒為Promega公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗分組 實(shí)驗分為五組：單純DMEM培養(yǎng)基不加藥組；雌二醇組（10 ng/mL）；金雀異黃素5 ng/mL+雌二醇組；金雀異黃素10 ng/mL+雌二醇組；金雀異黃素20 ng/mL+雌二醇組。

1.2.2 報告基因檢測 將乳腺癌細(xì)胞MCF7接種于24孔板，按“1.2.1”項下分組條件處理細(xì)胞，培養(yǎng)至對數(shù)生長期后，按照Fugene 6轉(zhuǎn)染試劑說明將2.0 μg報告基因質(zhì)粒pTAL-SEAP-ERE和校正質(zhì)粒pSV-β-gal（10 ng）轉(zhuǎn)染至乳腺癌細(xì)胞MCF7細(xì)胞中，繼續(xù)培養(yǎng)36 h，收集細(xì)胞按照雙報告基因檢測試劑盒說明檢測熒光素酶活性，每組3個復(fù)孔，每次數(shù)據(jù)重復(fù)3次。

1.2.3 Real-time PCR 將乳腺癌細(xì)胞MCF7細(xì)胞接種到6孔板中，按“1.2.1”項下分組條件處理細(xì)胞，48 h后收集細(xì)胞加入1 mL Trizol，按照Invitrogen反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。采用LightCycler實(shí)時定量PCR系統(tǒng)（Roche公司產(chǎn)品）進(jìn)行Real-time PCR。Real-time PCR引物按照文獻(xiàn)合成[9-10]。GREB1上游引物：5'-CAAAGAATAACCTGTTGGCCCTGC-3'，下游引物： 5'-CCAGTTGT-TGGCACTTCGG-3'；PDZK1上游引物：5'-AGAAATGGCCTCCACCTTCA-AC-3'， 下游引物5′-ACGGGCCCTCTAGACTCGAG-3'。GAPDH引物購自Takala公司。PDZK1和GREB1基因的擴(kuò)增條件為：95°C預(yù)變性2 min；95°C變性10 s， 60°C退火10 s， 72°C延伸10 s，共45個循環(huán)；72°C延伸5 min。用GAPDH的定量值對待測基因的定量值進(jìn)行均一化，進(jìn)而得到待測基因的相對表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗；以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 金雀異黃素對ERE報告基因轉(zhuǎn)錄的抑制作用

加入雌二醇后，ERE報告基因的轉(zhuǎn)錄活性較不加藥組提高約5倍，提示乳腺癌細(xì)胞MCF7細(xì)胞表面有ER表達(dá)，乳腺癌細(xì)胞MCF7細(xì)胞能夠?qū)Υ萍に禺a(chǎn)生應(yīng)答；隨著金雀異黃素濃度的增高，ERE報告基因的轉(zhuǎn)錄活性逐漸下降，金雀異黃素20 ng/mL+雌二醇組和雌二醇組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05或P < 0.01），說明金雀異黃素能夠和雌二醇競爭乳腺癌細(xì)胞MCF7細(xì)胞表面的ER，并抑制雌二醇的轉(zhuǎn)錄激活效應(yīng)。見表1。

表1 金雀異黃素對ERE報告基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用（x±s，n = 3）

注：t值和P值為與雌二醇組比較；“-”表示無數(shù)據(jù)

2.2 金雀異黃素對ER靶基因PDZK1和GREB1轉(zhuǎn)錄的抑制作用

為了確定金雀異黃素是否影響ER靶基因的轉(zhuǎn)錄，本研究采用Real-time PCR法檢測了ER靶基因PDZK1和GREB1 mRNA水平。結(jié)果顯示，隨著金雀異黃素濃度的增高，PDZK1和GREB1的轉(zhuǎn)錄水平逐漸下降，金雀異黃素20 ng/mL+雌二醇組和雌二醇組PDZK1和GREB1 mRNA水平差異均有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01），該結(jié)果和報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果一致，說明金雀異黃素可以拮抗雌激素調(diào)控的靶基因表達(dá)。見表2。

3 討論

金雀異黃素是來源于植物并有與雌激素相似結(jié)構(gòu)的植物雌激素（phytocstrogen），其雌激素的調(diào)節(jié)作用引起廣泛關(guān)注。目前植物雌激素作為激素替代藥物、抗癌藥物以及食品添加物和補(bǔ)充物應(yīng)用[11]。大豆異黃酮是大豆產(chǎn)生的天然植物雌激素，其化學(xué)結(jié)構(gòu)和雌二醇非常相似，而生物學(xué)活性卻只有雌二醇的1/10萬。近年研究證實(shí)，異黃酮的抗腫瘤效應(yīng)主要是通過兩種途徑完成的，一種是ER依賴性，一種是ER非依賴性。在ER依賴途徑中，異黃酮能夠和雌激素競爭細(xì)胞表面的ER，進(jìn)而拮抗雌激素調(diào)控的靶基因轉(zhuǎn)錄。在ER非依賴途徑中，大豆異黃酮可以通過抑制酪氨酸蛋白激酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶發(fā)揮抗腫瘤作用。酪氨酸激酶及拓?fù)洚悩?gòu)酶是細(xì)胞內(nèi)重要的功能酶，很多參與細(xì)胞增殖及DNA損傷修復(fù)的功能蛋白均是它們的作用底物，抑制酪氨酸激酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶的活性，可以阻斷細(xì)胞的生長激動信號，造成DNA損傷，促使細(xì)胞走向凋亡[12-14]。

徐琳琳等[15]認(rèn)為，腫瘤的發(fā)生發(fā)展是多因素、多階段的過程，其中既包括遺傳因素也涉及到非遺傳因素，如環(huán)境和飲食等。流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，攝入高含量的豆制品和綠茶可影響腫瘤及其他慢性疾病的發(fā)展[16]。金雀異黃素是大豆異黃酮的有效成分之一，已有研究資料表明，金雀異黃素是酪氨酸蛋白激酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶的強(qiáng)效抑制劑，金雀異黃素是否具有ER依賴性的抗腫瘤效應(yīng)目前還不明確。雌激素在乳腺癌的起始和進(jìn)展過程中充當(dāng)重要角色，雌激素通過核受體超家族成員ER調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄而控制生理和病理過程。ER是配體依賴型轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白，它調(diào)控細(xì)胞生長和分化許多方面的基因程序[17]。在研究金雀異黃素與人類健康的關(guān)系時，從細(xì)胞分子水平、動物模型到人體實(shí)驗、大規(guī)模流行病學(xué)調(diào)查的結(jié)果存在較大的爭議，實(shí)驗室中金雀異黃素用量通常遠(yuǎn)高于食物中的含量，且使用的種類、純度、用量，采用的細(xì)胞系以及其他實(shí)驗條件等均不盡相同，缺乏統(tǒng)一的評價標(biāo)準(zhǔn)，給金雀異黃素的研究工作和廣泛應(yīng)用帶來一定的困難。隨著對金雀異黃素功能性和營養(yǎng)性的深入研究，其提取及精制工藝的不斷完善，金雀異黃素將會在醫(yī)藥、保健品、食品、飲料及其它行業(yè)得到越來越廣泛的應(yīng)用[18]。本文以ER表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞MCF7作為研究對象，用不同濃度的金雀異黃素和雌二醇共同處理乳腺癌細(xì)胞MCF7細(xì)胞，結(jié)果顯示，金雀異黃素可以拮抗雌二醇的激動效應(yīng)，并且其競爭效應(yīng)和金雀異黃素的濃度具有相關(guān)性。金雀異黃素20 ng/mL+雌二醇組與單純雌二醇組比較，PDZK1和GREB1基因的轉(zhuǎn)錄水平差異顯著。這個結(jié)果說明金雀異黃素和大豆異黃酮的其他組分一樣，具有ER依賴性及ER非依賴的雙重抑癌效應(yīng)，本實(shí)驗為揭示金雀異黃素的作用機(jī)制提供了基礎(chǔ)資料。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 饒澄，黃顯.黃酮類化合物抗炎和抗腫瘤共同作用機(jī)制的研究進(jìn)展[J].海峽藥學(xué)，2010，22（6）：8-11.

[2] 伍瑩，劉江華.金雀異黃素防治絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥機(jī)制的研究進(jìn)展[J].國際病理科學(xué)與臨床雜志，2007，27（6）：530-533.

[3] Farina HG，Pomies M，Alonso DF，et al. Antitumor and antiangiogenic activity of soy isoflavone genistein in mouse models of melanoma and breast cancer [J]. Oncology Reports，2006，16（4）：885-891.

[4] 王麗斌，王玉華.金雀異黃素抗腫瘤實(shí)驗研究進(jìn)展[J].實(shí)用腫瘤雜志，2012，27（1）：96-100.

[5] 逢曉云，沈金芳，貢沁燕.大豆異黃酮對大鼠血脂的影響及其體內(nèi)外抗氧化作用研究[J].中國臨床藥理學(xué)與治療學(xué)，2008，13（1）：62-67.

[6] 郭瑞霞，馮俊霞，賈會珍，等.金雀異黃酮-4′-O糖苷的合成方法研究[J].河南化工，2013，30（4）：36-38.

[7] 馮淑瑩，李國明，侯瓊，等.金雀異黃素/殼聚糖微球的制備及其釋藥性能[J].華南師范大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2013，45（5）：64-67.

[8] 呂春秀.金雀異黃素誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的研究進(jìn)展[J].實(shí)用癌癥雜志，2011，26（1）：102-104.

[9] Hnatyszyn HJ，Liu M，Hilger A，et al. Correlation of GREB1 mRNA with protein expression in breast cancer：validation of a novel GREB1 monoclonal antibody [J]. Breast Cancer Research and Treatment，2009，122（2）：371-380.

[10] Wang P，Wang JJ，Xiao Y，et al. Interaction with PDZK1 is required for expression of organic anion transporting protein 1A1 on the hepatocyte surface [J]. Journal of Biological Chemistry，2005，280（34）：30143-30149.

[11] Naciff JM，Jump ML，Torontali SM，et al. Gene expreasion profile induced by 17alpha ethynyl eatradiol，bisphenolA，and genistein in the developing female reproductive system of the rat [J]. Toxicol SCI，2002，68（1）：184-199.

[12] 李欣，高金恒，陳國良.蛋白酪氨酸激酶抑制劑的研究發(fā)展[J].沈陽藥科大學(xué)學(xué)報，2011，28（12）：1005-1012.

[13] Pavese JM，F(xiàn)armer RL，Bergan RC. Inhibition of cancer cell invasion and metastasis by genistein[J]. Cancer and Metastasis Reviews，2010，29（3）：465-482.

[14] 韓磊，郭克建，周文平，等.Genistein對TGF-β1誘導(dǎo)人胰腺癌細(xì)胞上皮-間質(zhì)樣轉(zhuǎn)化的作用[J].世界華人消化雜志，2008，16（21）：2359-2363.

[15] 徐琳琳，孫慶敏，羅璇，等.金雀異黃素通過調(diào)控miR-27a及其靶基因?qū)β殉舶┘?xì)胞SKOV3生長的影響[J].中國臨床藥理學(xué)與治療學(xué)，2012，17（12）：1321-1326.

[16] Zhou JR，Yu LY，Mai ZM，et al. Combined inhibition of estrogen-dependent human breast carcinoma by soy and tea bioactive components in mice [J]. International Journal of Cancer，2004，108（1）：8-14.

[17] 沈麗霞，牛建昭，王繼峰.應(yīng)用基因芯片技術(shù)檢測金雀異黃素對乳腺癌T47D細(xì)胞雌激素受體相關(guān)信號通路基因表達(dá)的影響[J].北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2013，36（2）：100-103.

[18] 許銀燕，管靜.Genistein的生物學(xué)功能研究進(jìn)展[J].醫(yī)學(xué)綜述，2010，16（5）：735-737.

（收稿日期：2014-10-05 本文編輯：程 銘）