41例EDTA依賴性血小板降低的原因及校正方法探討

嚴強，古月

內江市市中區人民醫院檢驗科,四川內江 641000

血小板(Platelet,PLT)參與了人體凝血和止血效應，具有重要的生理學作用。血小板計數是判斷凝血功能的重要指標。血小板減少是引起患者出血時間延長的重要原因之一，患者在嚴重損傷或在激狀態可發生出血。假性血小板減少(pseudothrombocytopenia，PTCP）是由于各種原因引起的血小板聚集導致儀器計數血小板減少的假象。EDTA鹽抗凝劑是導致血常規分析血小板計數假性降低的主要原因,并建議改用枸櫞酸鈉抗凝劑重新采集患者血液標本進行血小板計數[1-2]。最近報道，枸櫞酸鹽同樣可以導致離體后的血液標本中血小板假性降低，并且隨著時間的延長，血小板計數降低得更明顯[3-4]。該研究采用血液分析儀稀釋法和肝素抗凝劑法對41例EDTA依賴性假性血小板降低的血液標本血小板檢測方法進行比較研究，旨在找出針對該類標本最適宜的血小板計數方法，避免因血小板假性降低導致的臨床誤診或漏診。

1 對象與方法

1.1 研究對象

回顧性分析2014年7月—2015年7月在日常的檢驗工作中發現的EDTA依賴性血小板降低的門診及住院患者共41例，其中男性 21例，女性 20例。

1.2 儀器與試劑

儀器為日本SYSMEX KX-21自動分析儀，試劑為均為儀器配套原裝試劑，真空采血管采用成都瑞琦科技實業有限責任公司生產的 EDTA-K2抗凝采血管和枸櫞酸鈉抗凝采血管。

1.3 研究方法

1.3.1 儀器全血法 采集患者外周靜脈血，注入EDTAK2抗凝的真空采血管，立即充分混勻后，嚴格按照儀器操作規程，在不同時間點(0～5 min、15 min、30 min、1 h、2 h)進行血小板計數。

1.3.2 儀器稀釋法 將EDTA-K2抗凝全血充分混勻后作26倍稀釋，即取20μL全血加入到500μL稀釋液中，充分混勻后在不同時間點(0～5 min、15 min30 min、1 h、2 h)，應用KX-21自動血液分析儀進行血小板測定。

1.3.3 枸櫞酸鈉抗凝劑法 對納入的研究對象，重新抽血外周靜脈血注入枸櫞酸鈉抗凝的真空采血管，立即充分混勻后，嚴格按照儀器操作規程，在不同時間點(0～5 min、15 min、30 min、1 h、2 h)在KX-21 自動血液分析儀上進行血小板計數。

1.3.4 手工法 以草酸銨作為抗凝劑，采用手工法進行計數。嚴格按照《全國臨床檢驗操作規程》第4版進行操作[5]。具體操作方法為:采患者指血20μL置于380μL草酸銨稀釋液中，充分混勻后在顯微鏡下計數。每份標本計數2次，取平均值。 同時，對每份血液標本采用瑞氏染色法進行血涂片染色，干燥后在顯微鏡下觀察血小板分布情況。

1.4 統計方法

采用SPSS 13.0統計軟件進行數據處理和統計學分析，計量資料以平均值±標準差（±s）表示，比較采用t檢驗，計數資料用率（%）表示，以P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 41例EDTA依賴性血小板降低的原因分析

對出現EDTA依賴性血小板降低的標本進行分析發現，導致該現象發生的具體原因包括血小板聚集、血小板衛星現象、采血不通暢、抗凝劑不足和抗凝劑過量，發生率分別為51.2%、2.4%、22.0%、9.8%和14.6%，見表1。

表1 41例EDTA依賴性血小板降低的原因分析

2.2 不同方法測定假性血小板降低的患者標本檢測結果

以手工法為判斷標準，在不同時間點分別用KX-21全血法、KX-21稀釋法和枸櫞酸鈉抗凝法對患者血小板進行測定，結果如表2所示。采血后0～5 min各種測定方法與手工法比較，血小板測定結果差異無統計學意義（P＞0.05）。而15 min后，KX-21儀器法與手工法比較，血小板測定結果差異具有統計學意義（P＜0.05）。稀釋法在2 h內與手工法測定結果差異無統計學意義（P＞0.05）。枸櫞酸鹽抗凝法在1 h后與手工法比較，血小板測定結果差異具有統計學意義（P＜0.05）。

表2 不同方法對假性血小板降低患者標本的測定結果比較（±s）

表2 不同方法對假性血小板降低患者標本的測定結果比較（±s）

注：△與手工法比較，P＞0.05；▲與手工法比較，P＜0.05。

測定時間KX-21全血法KX-21稀釋法 枸櫞酸鈉抗凝法 手工法0～5 min 15 min 30 min 1 h 2 h（231±32）△（79±26）▲（48±19）▲（21±6）▲（20±5）▲（228±29）△（225±30）△（221±33）△（226±35）△（231±36）△（223±23）△（226±21）△（169±17）△（101±14）▲（68±12）▲223±24 220±26 230±35 226±26 217±22

3 討論

血小板假性降低與多種疾病密切相關，往往伴發于外科手術、創傷、燒傷、膿毒血癥、腫瘤、自身免疫性疾病、血液系統疾病、傳染性單核細胞增多癥等。腫瘤患者長期使用化療或放療，不僅對造血系統產生抑制作用，而且會引起血小板結構和功能的改變。血液系統疾病如白血病等會嚴重影響造血功能，血小板不經數量減少，而且形態結構和功能也發生實質性改變，容易發生EDTA依賴性血小板降低。兒科患者主要是由于采血不通暢，采血過程中血小板聚集和粘附性改變，EDTA鹽進一步與血小板發生相互作用，聚集和凝集更為明顯。

目前認為，血小板假性降低主要與EDTA鹽抗凝劑有關[6-7]。PTCP的發生可能與EDTA鹽抗凝劑導致血小板活化過程有關，活化的血小板與存在于人體血液中的自身抗體結合，導致血小板形態結構發生改變，導致血小板膜表面的某種隱匿性抗原表位構象的改變，從而促進和加速了血小板與血漿中的纖維蛋白原聚集。此外，還可能與患者血液存在冷抗血小板的自身抗體有關[8]。這種EDTA依賴性冷抗血小板自身抗體直接作用于血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa，而糖蛋白Ⅱb/Ⅲa是血小板膜上最重要的糖蛋白，參與血小板的黏附、聚集反應[9]。與血小板結合的自身抗體Fc段可與單核細胞或淋巴細胞的Fc受體結合，出現血小板衛星現象[10]。

該研究通過對出現EDTA依賴性血小板降低的標本進行研究分析發現，導致該現象發生的具體原因主要包括血小板聚集、血小板衛星現象、采血不通暢、抗凝劑不足和抗凝劑過量，發生率分別為51.2%、2.4%、22.0%、9.8%和14.6%。這提示血小板聚集可能是發生EDTA依賴性血小板降低的主要機制。

目前，關于EDTA引起的假性血小板降低的校正方法，已報道的方法主要有3種，即直接手工計數、更換抗凝劑和即刻全血計數法[11-13]。以手工法為判斷標準，在不同時間點分別用KX-21全血法、KX-21稀釋法和枸櫞酸鈉抗凝法對患者PLT進行測定，結果如表2所示。采血后0～5 min各種測定方法與手工法比較，血小板測定結果差異無統計學意義（P＞0.05）。而15 min后，KX-21儀器法與手工法比較，血小板測定結果差異具有統計學意義（P＜0.05）。稀釋法在2 h內與手工法測定結果差異無統計學意義（P＞0.05）。枸櫞酸鹽抗凝法在1 h后與手工法比較，血小板測定結果差異具有統計學意義（P＜0.05）。枸櫞酸鹽抗凝劑計數血小板，在采血后短時間內不會引起血小板降低，而隨著時間的延長，血小板計數也會隨之下降。而血液分析儀稀釋法是一種較為理想的校正方法，測定速度快，可實現自動化檢測，準確度與手工計數法接近。與文獻報道相符[14]。

綜上可知，EDTA依賴性血小板降低發生的原因主要包括血小板聚集、血小板衛星現象、采血不通暢、抗凝劑不足和抗凝劑過量。當儀器出現與臨床診斷嚴重不符的血小板異常降低時，應及時分析原因，通過更換抗凝劑種類、適當控制標本放置時間，采取儀器稀釋法，或通過手工計數和血涂片染色觀察可有效區分真性與假血小板計數降低，從而提高檢測結果的準確度。血液分析儀稀釋法是一種較為理想的校正方法，用于臨床實驗室。

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