響應面法優化茶籽黃酮提取工藝條件

劉華鼐，李瓊，葉勇

（華南理工大學化學與化工學院，廣東廣州510641）

茶葉籽是山茶屬植物茶（L）即茶樹的果實，是茶葉生產的副產物。我國茶葉籽資源十分豐富，年產量約為80余萬噸，大部分用于榨取茶油，剩余的副產品中含有很多有效成分，如茶皂素、茶多糖、黃酮等，可研究利用價值很高。目前在國內對茶皂素、茶多糖的研究多見，而茶籽中黃酮的提取研究鮮見報道。黃酮類化合物可以防止心血管、腦血管和呼吸系統疾病，還有消炎，抑菌，抗糖尿病，抗輻射，抗癌，抗腫瘤和增強免疫等藥理作用，同時也是重要的功能食品添加劑、天然抗氧化劑、天然色素等。黃酮類化合物的提取方法主要有水和溶劑浸提法[1-2]、超聲波法和微波輔助提取法[3-4]、以及酶解法[5]等。

響應面分析法（RSM）是由Box—Wilson開發的一種綜合的數學建模、數據分析方法，主要用于化學過程中多個因素的因子優化。通過響應面法，可以對單個變量因子對目標變量的影響進行分析，也可以對多個試驗變量的最優搭配進行精確的數學估計，確定最優的因子條件。響應面法對工藝條件的優化具有更加可靠的數學依據支持，對最優條件的探索能精確到最具體的值，可以彌補正交試驗設計等方法的缺陷[6]。

本試驗以茶籽為原料，采用乙醇作為溶劑提取黃酮，研究了液料比、提取溫度、提取時間對黃酮提取率的影響；通過響應面法優化提取工藝條件。不但提高了茶籽中黃酮的提取率，而且極大地縮短了提取周期，該研究將利于茶籽的綜合利用。

1 材料與方法

1.1 原料和試劑

油茶籽：湖南茶農業有限公司；蘆丁標準品：美國sigma公司。

石油醚60～90、硝酸鋁、氫氧化鈉、亞硒酸鈉、乙醇，均為國產分析純。

1.2 主要儀器設備

DZF-6050真空干燥箱：上海博迅實業有限公司；UV-2800紫外可見分光光度計：尤尼柯上海儀器有限公司；WD-9419粉碎器：北京華運安特；JY10001分析電子天平：上海高致密儀器；DF-101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器：鞏義市予華儀器有限責任公司。

1.3 茶籽黃酮提取與分離工藝流程

茶葉籽去殼、干燥、粉碎，過60目篩得干粉。再取適量經過前處理的茶籽干粉，置于索氏提取器中用石油醚進行除油；然后取去油粉末3.000 g置于錐形瓶中用乙醇進行回流提取，一定時間后趁熱抽濾即得黃酮提取液。

1.4 方法

1.4.1 黃酮測定方法

以蘆丁標準樣為基準，采用硝酸鋁絡合-紫外分光光度法測定茶籽黃酮含量。所得蘆丁濃度（X）與吸光度（Y）的標準曲線適用范圍為（0～100 μg/mL）：Y=11.271X-0.010 7，R2=0.998 4。

1.4.2 單因素試驗

影響黃酮得率的因素比較多，本實驗主要從液料比、提取溫度、提取時間及乙醇的濃度等幾個方面進行單因素試驗。初步確定較佳的提取工藝條件。

1.4.3 響應面法優化茶籽黃酮提取條件研究

在單因素試驗的基礎上，根據Box-Behnken的中心組合試驗設計原理，選定乙醇濃度、液料比、提取溫度為考察因子，采用響應面法，在三因素三水平上對茶籽黃酮提取工藝進行優化試驗，響應面因素水平編碼表如表1所示。

表1 水平編碼表Table 1 Level code of each factor

1.4.4 數據分析

采用Desing-Expert8.0.5軟件對響應面的試驗數據進行二次多項回歸擬合、方差分析、顯著性檢測和響應面分析。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果及其分析

乙醇濃度、液料比、提取時間、提取溫度對黃酮得率的影響見圖1所示。

圖1 乙醇濃度、液料比、提取時間、提取溫度對黃酮得率的影響Fig.1 Effects of the ethanol concentration，the ratio of solid and solution，the time，and the temperature on the yield of total flavonoids

由圖1可知，由茶籽中提取黃酮較佳的工藝條件為：在80℃的溫度下，液料比為 25∶1（mL/g），乙醇濃度60%，提取2 h。

2.2 響應面試驗結果與分析

2.2.1 響應面法試驗結果

根據Box-Behnken中心組合試驗設計原理[7-9]，選定提取溫度，乙醇濃度和液料比作為考察因素（因為2 h后提取時間對總黃酮提取率影響不大，故設定2 h為最佳條件，不再進行考察）。在單因素試驗的基礎上，采用三因素三水平的響應曲面分析法進行分析。試驗結果如表2所示。通過Design Expert軟件對表2的試驗數據進行多元回歸擬合及對模型進行方差分析，得到以下回歸方程：Y=-59.064 68+0.524 36X1+1.001 08X2+1.476 37X3+0.001 752 52X1X2+0.003 396 7X1X3-0.006 230 85X2X3-0.004 616 08X12-0.007 971 38X22-0.023 330X32，式中：Y 為黃酮的提取率，mg/g；X1為提取溫度，℃；X2為乙醇濃度，%；X3為液料比，mL/g。

該方程中各項系數絕對值的大小直接反映各因素對響應值的影響程度，系數的正負反映了影響的方向。由于該方程的二次項系數均為負值，可以推斷方程代表的拋物面開口向下，因而具有極大值點，可以進行優化分析。由方程的一次項系數可以得出，影響茶籽黃酮提取率的主次順序為：液料比＞乙醇濃度＞提取溫度。

2.2.2 回歸方程的方差分析及系數顯著性分析

回歸模型方差分析見表2。

表2 響應面優化回歸方程的方差分析Fig.2 Variance analysis of regression equation

由表2可知，F值=27.7，P值為0.000 1，說明該模型是有效可靠的，達到極顯著水平（P＜0.001），有意義。失擬項是模型與實驗擬合程度的標準，本次模擬中失擬項的P值為0.052 9＞0.05，不顯著，對模型有利。R2=0.972 7，說明該模型能解釋97.27%響應值的變化，R2Adj=0.937 6，說明可信度較好，因此可以運用該擬合模型對對茶葉籽中總黃酮的提取率進行分析預測。

2.3 茶籽黃酮提取率的響應面分析圖

響應面分析圖是響應值對各試驗因子A、B、C所構成的響應面圖形。從響應面分析圖可形象地看出最佳參數及各參數之間的相互作用。當特征值均為正值時，響應圖為山谷形曲面，有極小值；當特征值為負值時，為山丘形曲面，有極大值存在；當特征值有正有負時，為馬鞍形曲面，無極值存在。本試驗根據回歸方程進行不同因子的響應面分析，等高線的形狀可反映出交互效應的強弱，馬鞍形或者橢圓形表示兩因素交互作用顯著，而圓形則與之相反。

圖2為各因素對黃酮提取率影響的響應面圖A。

對比3個響應面的形狀及參數，以及等高線分析，可以看出，響應面順著液料比的方向的陡度最大，結合方差分析，可以得出液料比在交互作用中對茶籽黃酮提取率的影響最顯著，乙醇濃度的影響次之，提取溫度的影響作用不夠顯著。對茶籽黃酮的提取率的影響的顯著性大小如下：液料比＞乙醇濃度＞提取溫度。

圖2 各因素及其交互作用對黃酮提取率影響的響應面曲面圖Fig.2 The effect of various factors and interaction on the yield of total flavonoids

利用RMS預測，通過對各個響應面的最高點的極值分析，通過對最高點取值，并對多元二次回歸方程進行求解，得出各個因子的解，這個值即是最優工藝條件為：提取液料比為28.52∶1（mL/g），乙醇體積分數濃度59.76%，提取溫度為77.91℃，在此條件下總黃酮提取2 h的理論值為13.342 4 mg/g。

2.4 工藝驗證試驗

采用Design-Expert軟件分析回歸模型，在各因素編碼水平范圍內，得出茶籽黃酮的最優工藝參數：液料比28∶1（mL/g）、乙醇體積分數 60%、提取溫度 78℃，提取時間2h。為驗證Box-Behnken試驗設計所得結果的可靠性，采用上述優化提取工藝條件進行驗證試驗，5次平行試驗所得茶籽黃酮平均得率為12.158 mg/g。與理論預測值誤差為8.8%，表明該優化參數可靠，具有實用價值。

3 結論

應用響應面法優化得到水提取茶籽黃酮的最優工藝條件是液料比28∶1（mL/g）、乙醇濃度60%、提取溫度78℃，提取時間2 h，測得的總黃酮平均含量為12.158 mg/g。得出結論液料比對總黃酮的提取率影響最大。因此，該研究結果對茶籽黃酮在茶籽綜合利用領域的深入開發提供了一定理論依據和參考。

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