牡蠣酶解液的脫腥工藝研究

劉艷，段振華，蔡彥，胡冰洋

（海南大學(xué)食品學(xué)院，海南?？?70228）

牡蠣是我國沿海最為常見的一種貝類，其肉質(zhì)肥美爽滑，營養(yǎng)豐富，素有“海底牛奶”之稱。2013年，我國牡蠣的產(chǎn)量將近420萬t，主要是鮮銷，開發(fā)的功能性食品較少。近年來關(guān)于牡蠣的研究較多，發(fā)現(xiàn)其酶解產(chǎn)物的生物活性成分有抗氧化、抗腫瘤、降血壓以及抑菌等作用[1-4]。牡蠣本身所具有的腥味以及酶解過程中產(chǎn)生的異味嚴重影響了牡蠣酶解產(chǎn)物的應(yīng)用。相關(guān)研究表明[5-6]，造成牡蠣酶解液不良風味的主要原因是酶解過程中牡蠣脂質(zhì)的氧化降解以及蛋白質(zhì)降解。牡蠣經(jīng)過均質(zhì)處理后，其肌肉組織受到機械損傷，不飽和脂肪酸暴露在空氣中，經(jīng)過蛋白酶酶解的作用，其質(zhì)構(gòu)變松散，導(dǎo)致脂肪與空氣中的氧氣接觸面積增大，加劇了氧化裂解。同時，蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)物氨基酸又同脂肪氧化產(chǎn)物共存，加強了酸敗作用，引起牡蠣酶解液色、香、味的不斷惡化。

目前，對于牡蠣酶解液脫腥的研究報道并不多。張梅超等[7]利用姜汁改善太平洋牡蠣酶解液的風味。葉盛權(quán)等[8]利用活性碳、β-環(huán)糊精、酵母發(fā)酵對酶解液進行脫腥。許慶陵等[9]發(fā)現(xiàn)美拉德反應(yīng)對酶解液脫腥效果優(yōu)于活性炭。劉慧等[10]對牡蠣蛋白飲料進行酵母粉發(fā)酵和活性炭吸附的復(fù)合脫腥處理后，能脫除酶解液中醛類等腥味物質(zhì)的主要成分。在多種除腥方法中，單一的脫腥技術(shù)并不能很好地把產(chǎn)品的腥味成分除去。脫腥效果有時不夠理想，采用兩種或兩種以上的脫腥技術(shù)，利用各方法之間的互補和協(xié)同增效作用，有助于獲得更優(yōu)的除腥效果[11]。

本研究首先對脫腥劑進行篩選，選擇脫腥效果較好的脫腥劑進行復(fù)合脫腥，達到高效脫腥的目的，又不損失酶解液中的活性成分。采用正交試驗進行優(yōu)化，從而得到酶解液的最佳脫腥工藝條件，為牡蠣脫腥技術(shù)以及相關(guān)保健食品的開發(fā)提供科學(xué)理論參考，為提高牡蠣產(chǎn)品的附加值開辟一條新途徑，對推動牡蠣深加工產(chǎn)業(yè)發(fā)展等具有重大意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牡蠣肉：?？谑醒亟髀忿r(nóng)貿(mào)市場；無花果蛋白酶（酶活力1.0×105U/g）：河南百盛化工產(chǎn)品有限公司；風味蛋白酶（酶活力 1.5×104U/g）、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）和β-環(huán)糊精：上海源葉生物科技有限公司；活性干酵母：安琪酵母股份有限公司；硅藻土：國藥集團化學(xué)試劑有限公司；活性炭：天津市大茂化學(xué)試劑廠；珍珠巖：信陽市平橋區(qū)巨匠珍珠巖廠，其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器設(shè)備

JJ-2組織搗碎機：常州澳華儀器有限公司；EL204電子天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；PHS-3C型實驗室pH計：上海偉業(yè)儀器廠；HH-S26S電熱恒溫水浴鍋：金壇市大地自動化儀器廠；85-1恒溫磁力攪拌器：金壇市富華儀器有限公司；TDL-4低速臺式離心機：上海安亭科學(xué)儀器廠；722可見分光光度計：上海奧譜勒儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 牡蠣酶解液的制備

將新鮮牡蠣肉清洗、瀝干，用組織搗碎機進行打漿，得到牡蠣肉漿。牡蠣肉漿與蒸餾水按照1∶2（g/mL）混合，加入12%（質(zhì)量分數(shù)）的兩種蛋白酶（無花果蛋白酶 ∶風味蛋白酶=3∶1），pH6.5、水浴50℃下水解3 h。酶解結(jié)束后沸水浴滅酶10 min，待冷卻至室溫（30℃）后于4 000 r/min離心20 min，取上清液即為牡蠣酶解液。

1.3.2 脫腥劑的篩選

將活性炭、活性干酵母[12]、硅藻土、珍珠巖和β-環(huán)糊精[13]按照表1的脫腥條件加入已制備的酶解液中，進行脫腥處理，結(jié)束后以慢速濾紙過濾，濾液即為脫腥液進行感官鑒定和抗氧化活性損失率的測定。

表1 5種脫腥劑的脫腥條件Table 1 Theconditions for five deodorization agents

1.3.3 氨基酸態(tài)氮損失率

氨基酸態(tài)氮含量測定：中性甲醛電位滴定法[14]。

式中：A為脫腥前酶解液的氨基酸態(tài)氮含量；B為脫腥后酶解液的氨基酸氮含量。

1.3.4 抗氧化活性損失率的測定

采用酶解液對DPPH自由基清除率的體外試驗法[15]分別測定脫色前后酶解液的DPPH自由基清除率，計算抗氧化活性損失率。

式中：SA0為酶解液脫腥前的DPPH·清除率；SA1為酶解液脫腥后的DPPH·清除率。

1.3.5 感官鑒定方法[16]

感官評定鑒評小組由10名（22至28歲）評定員組成，系統(tǒng)學(xué)習(xí)過感官評定課程，有豐富的感官評定經(jīng)驗。這10個人對酶解液的顏色、氣味、腥味進行綜合評價，并按1～9（9表示最好，1表示最差）等級進行分類評比，感官鑒定值為10人評定小組的平均得分見表2。以去離子水為對照（分值為9）。

表2 評分標準Table 2 Sensory evaluation judgment

2 結(jié)果與分析

2.1 脫腥劑的篩選

試驗選用活性炭、硅藻土、珍珠巖、活性干酵母和β-環(huán)糊精對牡蠣酶解液進行脫腥處理。結(jié)果如圖1所示。

圖1 脫腥劑對牡蠣酶解液脫腥效果的影響Fig.1 Effect ofdeodorization agent onoyster enzymatic hydrolysatedeodorization

活性炭一種多孔性含碳物質(zhì)，依靠表面多孔隙結(jié)構(gòu)和巨大比表面積，具有極強吸附力，對腥味的脫除效果較好，但缺點就是活性損失較大；酵母粉脫腥效果較好，抗氧化活性損失率較低，還伴有濃郁的酵母香味；硅藻土脫腥效果可以，但是脫腥后酶解液中有硅藻土本身的泥土味，同時抗氧化活性損失率較大；β-環(huán)糊精和珍珠巖脫腥效果雖不及活性炭、酵母粉等，但是其抗氧化活性損失率低，并且脫腥后沒有摻雜其他異味。綜合考慮，選擇活性干酵母、β-環(huán)糊精和珍珠巖繼續(xù)做后面的復(fù)合脫腥試驗。

2.2 3種脫腥劑不同復(fù)合脫腥方式的對比

活性干酵母、β-環(huán)糊精和珍珠巖這3種脫腥劑，兩兩進行復(fù)合脫腥，其脫腥效果如圖2所示。

圖2 不同復(fù)合脫腥方式對脫腥效果的影響Fig.2 Effect of different composite methods on oyster enzymatic hydrolysate deodorization

6種不同的脫腥方式，其脫腥效果不同，由圖2可知，活性干酵母脫腥聯(lián)合珍珠巖和活性干酵母聯(lián)合β-環(huán)糊精這兩種脫腥效果較好，感官評分較高，并且其抗氧化活性損失率也相對較低。β-環(huán)糊精脫腥后再聯(lián)合活性干酵母的脫腥方式，雖抗氧化活性損失率較低，但感官評分不高。另外3種聯(lián)合脫腥的方式，都存在感官評分低、抗氧化活性損失率較大的缺點。故進一步對活性干酵母聯(lián)合珍珠巖和活性干酵母聯(lián)合β-環(huán)糊精這兩種脫腥方式進行工藝優(yōu)化。

2.3 活性干酵母脫腥工藝條件的優(yōu)化

活性干酵母能將醛、酮等腥味成分吸附或?qū)⑵滢D(zhuǎn)化為無腥味物質(zhì)，從而達到脫腥目的。酵母對腥苦味的脫除可能是由于酵母疏松的結(jié)構(gòu)對異味物質(zhì)的吸附作用，酵母和部分異味物質(zhì)合成大分子物質(zhì)被除去或酵母含有的多種酶把異味物質(zhì)轉(zhuǎn)化為無異味物質(zhì)，同時發(fā)酵過程中產(chǎn)生一些中間代謝產(chǎn)物，對異味有一定的掩蔽作用[17]。活性干酵母對牡蠣酶解液脫腥的正交試驗結(jié)果見表3。

表3 活性干酵母對牡蠣酶解液進行脫腥處理的正交試驗結(jié)果L9（34）Table 3The orthogonal test results L9（34）of deodorization processing for oyster enzymatic hydrolysate by yeast fermentation

綜合考慮感官評分、抗氧化活性損失率和氨基酸態(tài)氮損失率這3個指標，活性干酵母脫腥最佳工藝條件為A2B3C3，即活性干酵母添加量1.0%，脫腥時間45 min，脫腥溫度40℃。

2.4 珍珠巖聯(lián)合酵母發(fā)酵脫腥工藝條件優(yōu)化

將1.0%的安琪高活性干酵母加入牡蠣酶解液中，在40℃脫腥45 min，離心過濾后用珍珠巖脫腥，設(shè)計三因素三水平L9（34）正交試驗。珍珠巖處理酵母脫腥酶解液的正交試驗結(jié)果見表4。

表4 珍珠巖處理酵母脫腥酶解液的正交試驗結(jié)果L9（34）Table 4The orthogonal test results L9（34）of perlitefor the oyster enzymatic hydrolysate deodorized by yeast

珍珠巖具有多孔的膨脹空腔結(jié)構(gòu)，能夠有效地吸附腥味小分子物質(zhì)。根據(jù)表4中極差R的大小，得到各因素對各個指標影響的主次順序，并得到不同指標下的最優(yōu)水平，再綜合考慮感官評分、抗氧化活性損失率和氨基酸態(tài)氮損失率這3個指標，珍珠巖用量對感官評分和氨基酸態(tài)氮損失率影響較大，故珍珠巖用量選A3，即12%；溫度對感官評分、抗氧化活性損失率和氨基酸態(tài)氮損失率這3個指標影響均較小，40℃和50℃對感官評分的影響不明顯，但是50℃時抗氧化活性損失率和氨基酸態(tài)氮損失率的影響均最低，故選擇最佳溫度為B2，即50℃；時間對抗氧化活性損失率影響最大，對感官評分和氨基酸態(tài)氮損失率的影響相對較小，故選擇最佳時間40 min。綜上所述，珍珠巖處理酵母脫腥酶解液的最佳組合為A3B2C1，即珍珠巖添加量12%，溫度50℃，脫腥時間為40 min。

2.5 β-環(huán)糊精聯(lián)合酵母發(fā)酵脫腥工藝條件優(yōu)化

活性干酵母對牡蠣酶解液有較好的脫腥效果，但酵母對牡蠣酶解液脫腥的同時容易在酶解液中產(chǎn)生殘留酵母發(fā)酵的味道和發(fā)酵酸味，影響酶解液的風味。β-環(huán)糊精是環(huán)狀的葡萄糖聚合物，分子呈筒狀結(jié)構(gòu)，具有1個立體的疏水空腔，以范德華力、疏水作用力等與客體分子形成超微囊狀包合物，達到除腥目的[18-19]。因此，考慮利用β-環(huán)狀糊精的包埋作用除去殘留酵母發(fā)酵的味道和發(fā)酵酸。將1.0%的安琪高活性干酵母加入牡蠣酶解液中，在40℃脫腥45 min，離心過濾后用β-環(huán)糊精脫腥，設(shè)計三因素三水平L9（34）正交試驗，見表5。

表5 β-環(huán)糊精處理酵母脫腥酶解液的正交試驗結(jié)果Table 5The orthogonal test results L9（34）ofβ-cyclodextrin for the oyster enzymatic hydrolysate deodorized by yeast

綜合考慮感官評分、抗氧化活性損失率和氨基酸態(tài)氮損失率，β-環(huán)糊精處理活性干酵母脫腥酶解液的最佳工藝條件為A2B3C3，即β-環(huán)糊精添加量3.5%，脫腥溫度65℃，脫腥時間60 min。

2.6 兩種最佳脫腥方法的驗證及對比試驗

將上述優(yōu)化的兩種最佳工藝：①將1.0%的安琪高活性干酵母，在40℃脫腥45 min，離心過濾后用珍珠巖12%，溫度50℃，脫腥40 min；②將1.0%的安琪高活性干酵母，在40℃脫腥45 min，離心過濾后用β－環(huán)糊精3.5%，溫度65℃，脫腥60 min，進行對比，具體數(shù)據(jù)見表6。

表6 兩種最佳脫腥工藝的對比試驗Table 6 The contrast tests of two optimal deodorization process

由表6可知，經(jīng)過先酵母脫腥后珍珠巖處理的聯(lián)合脫腥驗證試驗結(jié)果顯示，用此種聯(lián)合脫腥法對牡蠣酶解液脫腥，可以有效脫除腥味，感官評分達到8.6，抗氧化活性損失率為16.22%，氨基酸態(tài)氮損失率為2.59%。

3 結(jié)論

由脫腥劑篩選試驗，確定活性干酵母、珍珠巖和β-環(huán)糊精對牡蠣酶解液脫腥效果較好。這3種不同脫腥劑的不同復(fù)合脫腥方式研究發(fā)現(xiàn)，活性干酵母聯(lián)合珍珠巖脫腥和活性干酵母發(fā)酵聯(lián)合β-環(huán)糊精脫腥對牡蠣酶解液脫腥較好，進行正交試驗優(yōu)化，得到牡蠣酶解液最佳的脫腥方式是安琪高活性干酵母聯(lián)合珍珠巖。脫腥工藝條件是先添加1.0%的安琪高活性干酵母，在40℃脫腥45 min，離心過濾后用12%的珍珠巖在50℃下脫腥40 min，脫腥液基本上沒有腥味，而且還有一股酵母所特有的香味，顏色比較澄清，感官評分達到8.6，氨基酸態(tài)氮損失率為2.59%，抗氧化活性損失率為16.22%。

[1] 余杰,楊振國,鐘煉,等.酶法制備牡蠣抗氧化肽研究[J].中國海洋藥物,2012(3):31-36

[2] 陳艷輝,李超柱,黎丹戎,等.動物蛋白酶酶解制備廣西產(chǎn)牡蠣肉抗腫瘤活性肽的實驗研究[J].食品工業(yè)科技,2010,31(8):167-169

[3] Wang J P,Hu J E,Cui J Z,et al.Purification and identification of a ACE inhibitory peptide from oyster proteins hydro1ysate and the antihypertensive effect of hydro1ysate in spontaneously hypertensive rats[J].Food Chemistry,2008,111(2):302-308

[4] 盧學(xué)敏,王頎林,藍曉燕,等.牡蠣活性多肽的抑菌作用與抗氧化性能研究[J].中國釀造,2013,32(2):77-80

[5] Fu X J,Xu S Y,Wang Z.Kinetics of lipid oxidation and off-odor formation in silver carp mince:the effect of lipoxygenase and hemoglobin[J].Food Research International,2009,42(1):85-90

[6] SELLI S,PROST C,SEROT T.Odour-active and off-odour components in rainbow trout(Oncorhynchusmykiss)extracts obtained by microwave assisted distillation-solvent extraction[J].Food Chemistry,2009,114(1):317-322

[7] 張梅超,慕金雨,劉敏,等.姜汁對太平洋牡蠣(Crassostreagigas)酶解液風味改善的研究[J].食品科學(xué),2014,35(17):170-175

[8] 葉盛權(quán),吳暉,賴富饒,等.牡蠣酶解過程的成分變化及脫腥初步研究[J].現(xiàn)代食品科技,2009,25(3):262-265

[9] 許慶陵,周勇強,戰(zhàn)宇,等.牡蠣水解蛋白制備及脫腥技術(shù)研究[J].食品研究與開發(fā),2012,33(10):1-5

[10]劉慧,秦小明,林華娟,等.牡蠣蛋白飲料脫腥技術(shù)的研究[J].中國食品學(xué)報,2012,12(9):78-86

[11]翁麗萍,陳飛東,李峰,等.國內(nèi)外淡水產(chǎn)品腥味物質(zhì)及脫腥技術(shù)研究進展[J].食品工業(yè),2014,35(5):195-200

[12]徐律,楊最素,郁迪,等.菲律賓蛤仔酶解液脫腥工藝研究[J].浙江海洋學(xué)院學(xué)報(自然科學(xué)版),2014,34(1):79-84,91

[13]段振華,易美華,王菊蘭,等.羅非魚碎魚肉酶解液的脫腥技術(shù)及其機理探討[J].食品工業(yè)科技,2007,28(2):65-67

[14]Duan Z H,Wang J L,Yi M H,et al.Recovery of Proteins from Silver carp By-products with Enzymatic Hydrolysis and Reduction of Bitterness in Hydrolysate[J].Journal of Food Process Engineering,2010,33(5):962-978

[15]雷丹青,周先果,張輝,等.牡蠣酶解液的抗氧化活性研究[J].時珍國醫(yī)國藥,2008,19(11):2674-2676

[16]郭玉華,李玨金,吳新穎,等.鱈魚皮膠原蛋白肽酶解液脫色脫腥工藝的研究[J].中國食品添加劑,2010(4):125-128

[17]楊玉平,熊光權(quán),程薇,等.水產(chǎn)品異味物質(zhì)形成機理、檢測及去除技術(shù)研究[J].食品科學(xué),2009,30(23):6

[18]余德順,楊明.β-環(huán)糊精包埋技術(shù)及研究進展[J].重慶理工大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)),2010,24(11):44-49

[19]于笛,鄭杰,陳沖,等.方氏云鳚水解液脫腥脫苦的研究[J].中國食品添加劑,2014(9):101-106