椰纖果生產中椰子水自然發酵過程成分及微生物群落變化

楊一沖，李從發，鄧健，劉龍祥，胡淇淞，畢繼才，陳華美，章翠，劉四新

（海南大學，海南?？?70228）

椰纖果（nata de coco），又名椰果，是在食品工業中應用的細菌纖維素。椰纖果食品因富含膳食纖維、熱值低、不含膽固醇，且口感脆嫩爽滑一直在中國及其他東南亞地區熱銷不衰。其實，椰纖果由于就是細菌纖維素、具有許多優良特性，如化學純度高、生物相容性好、可生物降解等而在醫藥、化工等領域具有更廣闊、附加價值更高的應用，是世界上公認的性能優異的新型生物材料[1-4]。

椰子水因富含營養、一直是海南和其他東南亞地區生產椰纖果的主要原料。本實驗室及海南生產企業長期的實踐表明，椰子水經過一段時間的自然發酵，其椰纖果產量遠較使用新鮮椰子水高。但據了解，各地區生產nata的椰子水處理方式不完全相同，如泰國是用新鮮椰子水生產、越南是用發酵椰子水生產，印尼既用發酵椰子水也用新鮮椰子水、菲律賓則多用椰漿。椰子水原料在不同地區處理方式的不同，可能與所用菌種、菌株的不同有關，也與發酵條件和工藝不盡相同有關。在海南，椰纖果生產由于都使用自然發酵的椰子水，椰子加工廠常將椰子水隨意放置，甚至發酸、變味。由于不同廠家環境、或不同季節、甚至原料椰子的產地不同，都會使椰子水的前期發酵呈現復雜和多變的狀況，因此給椰纖果生產的直接影響就是椰纖果產量和品質很不穩定。并且由于是自然發酵，不排除有害微生物生長的可能，這也給椰纖果生產帶來不安全隱患。

因此，研究椰子水在自然發酵過程中的成分及微生物群落變化是非常必要的，可以為進而研究其菌相變化、為闡明對椰纖果生產有促進作用以及負向作用的主要微生物和成分等奠定基礎，特別是為探明椰子水自然發酵狀態下是否有、哪些是不安全因素、以及如何防范等做好前期工作。相關文獻鮮見報道。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 椰子水樣品

?？谑惺酆Ｄ媳镜匦迈r椰子，破殼取水，紗布過濾、分裝于潔凈礦泉瓶，無菌透氣封口膜封口，室溫下靜置存放，自然發酵0 d～8 d，每天取樣。將每瓶樣品分為兩份：一份用于微生物的測數和分離，另一份做成分分析。

1.1.2 培養基

麥芽汁培養基、M17培養基、結晶紫中性紅膽鹽（VRBG）培養基均購自青島日水生物技術有限公司，PCA培養基、酸化MRS培養基、改良Chalmers培養基、醋酸菌（AAB）培養基[5-7]。

上述培養基于121℃滅菌20 min，待冷卻至50℃加入0.1%那他霉素（麥芽汁培養基除外），搖勻；固體培養基添加2%瓊脂后滅菌，冷卻后加入0.1%那他霉素混勻、倒平板。

1.1.3 主要儀器設備

1260液相色譜儀：安捷倫科技有限公司；SKY-2112B立式雙層大容量恒溫培養箱：金壇市盛藍儀器有限制造公司；Delta320-SpH計：梅特勒-托利多儀器有限公司；WYT手持折光糖度儀：成都市青年聯合光學儀器成套部。

1.2 方法

1.2.1 成分分析

用注射器取椰子水液面下5 cm處0.2 mL樣品滴于pHS-25數顯酸度計中測定pH；總酸測定采用氫氧化鈉溶液滴定法[8]；可溶性固形物測定采用手持糖度儀進行檢測，結果以°Bx表示；還原糖測定采用3，5-二硝基水楊酸（DNS）比色法[9]。

乳酸和醋酸測定樣液的制備：將待測樣品與硫酸鋅（72 g/L），三水合鐵氰化鉀（36 g/L），以 1∶1∶1的比例混合，10 000 r/min離心 10 min，0.22 μm 的微孔濾膜過濾過濾，進樣量為10 μL，重復進樣3次，用各有機酸的回歸方程計算各種成分的含量。

液相色譜條件：分析儀器為Agilent1260型高效液相色譜儀，色譜柱為AgilentZORBAX-SB-Aq（250 mm×4.6 mm），流動相為用高氯酸調pH2.5的水溶液作為流動相；流速：0.6 mL/min；柱溫 55℃，檢測器為VWDVL+，檢測波長為210 nm進樣量：10 μL。采用外標法進行定量分析。

1.2.2 椰子水自然發酵過程中微生物的分離計數

在不同平板培養基上分別分離純化真菌和細菌。30℃恒溫培養48 h～72 h，選擇合適的稀釋濃度觀察并記錄菌落個數。

2 結果與分析

2.1 椰子水自然發酵過程中可溶性固形物及還原糖變化

椰子水自然發酵過程中可溶性固形物及還原糖變化見圖1。

圖1 椰子水發酵過程中可溶性固形物及還原糖變化Fig.1 Changes in soluble solidsand reducing sugar during the natural fermentation of coconut water

還原糖的下降趨勢與可溶性固形物基本一致，發酵前3 d還原糖下降速度較快，因其作為速效碳源能迅速被各種微生物利用，用于細胞繁殖。3 d后還原糖消耗減緩。可溶性固形物因其構成較復雜，被利用和消耗的變化幅度較緩和，推測這也與其中的微生物會同時產生各種代謝產物有關。

2.2 椰子水自然發酵過程中pH及總酸變化

新鮮椰子水的原始pH一般在4.5～5.3左右[10]，此次測定值為5.14，椰子水自然發酵過程中pH變化見圖2。

圖2 椰子水自然發酵過程中pH及總酸變化Fig.2 Changes of pH and titratable acid value during the natural fermentation of coconut water

在發酵前3 d，pH迅速下降，到發酵第4天～第5天后趨于平穩、最后保持在3.8左右。這較前人研究的椰子水經自然發酵5 d的pH3.64為高[11]，這可能是環境不同，所生長的微生物區系不同所致。

新鮮椰子水的總酸含量在前2 d迅速升高，隨后降低，到第4天后又緩慢上升。這可能是一些耐酸微生物在初期繁殖起來后代謝了一部分有機酸類、導致總酸下降，然后后期可能是一些兼性厭氧微生物持續生長、產酸又使總酸上升。但后期pH變化較之總酸緩和可能與體系里復雜多樣的產物使其具有一定緩沖能力有關。

2.3 椰子水自然發酵過程中乙酸和乳酸變化

在椰纖果的生產中，劉四新等曾直接用新鮮椰子水，但須用乙酸調節pH值，若用其他常用無機酸或有機酸調節則可能產量降低或不產。故推測自然發酵椰子水中乙酸等對椰纖果合成具有重要意義[12]。本研究以液相色譜法著重測定了乙酸和乳酸變化情況，在椰子水自然發酵過程中其變化見圖3。

圖3 乳酸和乙酸濃度變化Fig.3 Changes lactic acid and acetic acid concentration

顯示椰子水自然發酵過程中，乙酸產量并不大、且變化不顯著，而乳酸產量極顯著高于乙酸，推測自然發酵椰子水體系中有大量各種乳酸菌的繁殖和消長，且產生的乳酸可能對椰纖果的合成起到一定的促進作用。

2.4 椰子水自然發酵過程中微生物數量變化

椰子水自然發酵過程中細菌和真菌菌落數量變化見圖4。

圖4 細菌和真菌菌落數量變化Fig.4 Changes of aerobic plate count of bacteria and fungi

在椰子水自然發酵過程中同時存在細菌和真菌兩類微生物，且細菌類數量更多，真菌中又以酵母菌占絕對優勢，霉菌數量很少。圖4顯示，細菌的增殖十分旺盛，第1天數量就達到1×1010，且第2天達到高峰，隨后稍降并維持在1×109以上，第6天又一次超過1×1010。而真菌數量高峰稍滯后于細菌、于第3天達到約1×109，隨后一直呈緩慢下降趨勢?？梢姡⑸锟倲底兓幝膳c還原糖、可溶性固形物和總酸、pH的變化是基本吻合的，即在前3天是微生物總數呈對數增長的階段，而后真菌數量減少，但細菌類數量始終維持較高水平。

2.5 椰子水自然發酵過程中細菌群落變化

發酵體系中細菌群落變化如圖5所示。

圖5 椰子水自然發酵過程中細菌群落變化Fig.5 Changes in APC values of bacteria during the natural fermentation of coconut water

乳酸菌和醋酸菌在體系中數量最多、占主要優勢，且都在第2天達到峰值，隨后3 d～6 d稍降，又都在第7天小幅回升。結合乙酸和乳酸成分變化，說明這兩類菌的增殖變化趨勢基本一致，且兩類菌對成分變化有較大影響。另外，大腸菌群和芽孢菌的變化趨勢也比較接近，最高數量都發生在第1天，之后呈持續下降的趨勢。這兩類菌是發酵椰子水中可能的不安全因素，雖然其數量會隨著發酵時間而下降，而且在椰纖果工業生產中會將自然發酵椰子水煮沸滅菌再使用，但因芽孢桿菌耐高溫的特點，也容易發生滅菌不徹底而導致椰纖果發酵的產量和品質不穩定等問題。

3 討論與結論

本試驗以自然發酵椰子水為研究對象，對其發酵過程進行了系統的研究，在測定了發酵體系中常規成分變化的同時，解析了發酵過程中的微生物數量和群落的變化，獲得如下結論：

在實驗室條件下，自然發酵的椰子水可溶性固形物及還原糖變化主要出現在發酵前3 d，在此期間，pH也急劇下降，然后穩定在pH3.8左右；總酸含量在第2天達到第一個高峰，隨后先下降后上升；在觀察結束時體系中的乳酸和乙酸含量分別為1.54g/L和0.28g/L；發酵初期，各種微生物迅速増殖，也在前3 d達到最大值，而后真菌數量逐漸減少，細菌數量始終維持在較高水平。在細菌體系中檢測到了乳酸菌、醋酸菌、腸菌群、芽孢桿菌，其中乳酸菌和醋酸菌數量最多，且對成分變化有較大影響，而腸菌群和芽孢桿菌的存在也使得自然發酵椰子水存在一定安全隱患。雖然在椰纖果工業生產中會將自然發酵椰子水煮沸滅菌，但因芽孢桿菌耐高溫的特點容易發生滅菌不徹底而導致的產量不穩定及存在安全隱患。

根據本試驗結果，可進一步研究自然發酵椰子水中的菌相變化，并在此基礎上，結合后期的深入研究，有可能分析出對產量穩定和產品安全不利的有害菌，為有效避免不穩定的自然發酵，避免其可能產生的安全隱患問題而奠定良好的基礎。這將為海南椰纖果行業擺脫椰子水的放任式自然發酵，走向高產、高效、安全的生產新模式尋找出路，也對提升海南椰纖果行業現行生產水平和品質安全產生深遠的意義。

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