以纖維素為原料發(fā)酵檸檬酸培養(yǎng)基的研究

孫科，周鳳俠

（1.徐州生物工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物工程系，江蘇徐州221006；2.中央農(nóng)業(yè)廣播學(xué)校徐州分校，江蘇徐州221000）

傳統(tǒng)的黑曲霉發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸主要以薯干為原料，2010年以來由于薯干價格大幅度上漲，致使檸檬酸發(fā)酵行業(yè)成本大幅提高[1-2]。而纖維素經(jīng)過處理也可以產(chǎn)生可發(fā)酵性糖，上世紀末對纖維素作為發(fā)酵的原料研究較多，本文研究了實驗室保藏的黑曲霉XSY0607菌株以水稻秸稈為原料發(fā)酵檸檬素的培養(yǎng)基的優(yōu)化，目的是解決檸檬酸發(fā)酵過程中產(chǎn)生的問題，盡可能的降低成本，提高產(chǎn)品質(zhì)量。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與培養(yǎng)基

1.1.1 菌種

黑曲霉（Aspergillus niger）XSY0607：實驗室保藏菌種。

1.1.2 斜面培養(yǎng)基[3-4]

羥甲基纖維素鈉（CMC-Na）：0.5%；酵母膏：0.15%；（NH4）2SO4：0.2%；瓊脂：2%；pH：自然。

1.1.3 種子培養(yǎng)基[5]

水稻秸稈粉：5%；小麥麩皮：0.5%；（NH4）2SO4：0.25%；玉米粉：1%；CaCl2：0.1%；pH：自然。

1.1.4 發(fā)酵培養(yǎng)基[6-7]

水稻秸稈粉：5.5%；（NH4）2SO4：0.16%；MgSO4：0.02%；蛋白胨：3%；KH2PO4：0.2%；CaCl2：0.001%；ZnCl2：0.000 2%；尿素：0.02%；pH：5.0。

1.1.5 發(fā)酵原料

水稻秸稈：粉碎過60目篩；麩皮：過60目篩；黃豆餅粉：過60目篩；（NH4）2SO4（分析純）：北京裕策達科貿(mào)有限公司；MgSO4（分析純）：深圳市博林達科技有限公司；CaCl2（分析純）：天津迪博化工股份有限公司；KH2PO4（分析純）：上海壘固儀器有限公司；ZnCl2（分析純）：天津市北辰方正試劑廠。

1.2 試驗儀器與方法

1.2.1 儀器

恒溫水浴鍋：上海一凱儀器設(shè)備有限公司；FA1204B電子分析天平：上海精科天美貿(mào)易有限公司；LRH-70生化培養(yǎng)箱：上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；XSP-SG-63X顯微鏡：上海光學(xué)儀器廠；723N可見分光光度計：上海儀電分析儀器有限公司；MP512-03精密pH計：上海精密儀器儀表有限公司；LC-100高效液相色譜：上海伍豐科學(xué)儀器有限公司；7L實驗室不銹鋼發(fā)酵罐：鎮(zhèn)江貝利生物工程有限；SW-CJ-2F超凈工作臺：上海陽光實驗儀器有限公司；TGL-18C高速臺式離心機：上海安亭科學(xué)儀器廠；MLS-3780高壓蒸汽滅菌鍋：杭州亞旭生物科技有限公司；Ba-1旋轉(zhuǎn)式搖床：江蘇省金壇市環(huán)宇科學(xué)儀器廠；FCW系列超微粉碎機：青島即墨市超微粉碎機廠。

1.2.2 菌株培養(yǎng)方法

在無菌條件下，取出保藏的菌種黑曲霉（Aspergillus niger）XSY0607，接種到斜面培養(yǎng)基上，30℃活化培養(yǎng)48 h，然后轉(zhuǎn)接如茄形瓶中，30℃恒溫培養(yǎng)24 h。再用無菌水洗下茄形瓶中成熟孢子，接入500 mL三角瓶裝有50 mL種子培養(yǎng)基，30℃150 r/min震蕩培養(yǎng)28 h。然后將種子液轉(zhuǎn)接至裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的7 L小型不銹鋼發(fā)酵罐中，通風(fēng)攪拌培養(yǎng)5 d。

1.2.3 檸檬酸測定的方法

采用高效液相色譜法測定檸檬酸的含量[4，8-9]。

2 結(jié)果與分析

2.1 碳源對產(chǎn)酸的影響

分別以5%水稻秸稈粉、小麥秸稈粉、玉米秸稈粉、木屑粉、青草粉過60目篩作為碳源，進行小型發(fā)酵罐的發(fā)酵試驗，發(fā)酵5 d后，通過高效液相色譜儀測檸檬酸產(chǎn)量，結(jié)果如圖1所示。

圖1 碳源對產(chǎn)酸的影響Fig.1 Effect of carbon source on acid production

由于纖維素酶是誘導(dǎo)酶，所以采用了5種天然的纖維素作為碳源。一可以誘導(dǎo)纖維素酶的產(chǎn)生，二來可以解決成本，三可以嘗試為檸檬酸發(fā)酵開辟更廣的原料來源。從圖1可以看出：5種纖維素原料作為碳源，水稻秸稈產(chǎn)酸能力最強，其次是玉米秸稈，產(chǎn)酸能力最差的是木屑，可能是木屑中含有大量的木質(zhì)素有關(guān)。

2.2 氮源對產(chǎn)酸的影響

分別以過60目篩的黃豆餅粉、酵母膏、蛋白胨、玉米漿和尿素作為氮源，進行小型發(fā)酵罐的發(fā)酵試驗，發(fā)酵5 d后，通過高效液相色譜儀測檸檬酸產(chǎn)量，結(jié)果如圖2所示。

圖2 氮源對產(chǎn)酸的影響Fig.2 Effect of nitrogen source on acid production

從圖2可以看出：5種氮源對檸檬酸的產(chǎn)量的影響不同，蛋白胨對黑曲霉XSY0607菌株產(chǎn)酸能力影響最大，其次是尿素，再次是玉米漿，最后是黃豆餅粉。所以，黑曲霉XSY0607發(fā)酵生產(chǎn)檸檬素最好的氮源是蛋白胨。

2.3 表面活性劑對產(chǎn)酸的影響

表面活性劑可以增加黑曲霉細胞膜的透性，有利于纖維素酶的分泌，同時也有利于檸檬酸的分泌。本實驗分別在培養(yǎng)基加入0.1%的吐溫-80、SDS、膽汁酸和聚乙二醇作為表面活性劑，尋找對檸檬酸發(fā)酵最適的表面活性劑。試驗結(jié)果如圖3所示。

圖3 表面活性劑對產(chǎn)酸的影響Fig.3 Effect of surfactant on acid production

從圖3可以看出：幾種表面活性劑都能很大的促進檸檬酸的產(chǎn)量，都比空白對照組的產(chǎn)量要高的多；其中對檸檬酸產(chǎn)量影響最大的是聚乙二醇，其次是吐溫-80，最后的是膽汁酸。本實驗采用聚乙二醇作為檸檬酸發(fā)酵的表面活性劑。

2.4 初始pH對產(chǎn)酸的影響

用1 mol/L的HCl和1 mol/L的NaOH調(diào)節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH，考察不同的初始pH對檸檬酸產(chǎn)量的影響。結(jié)果如圖4所示。

圖4 初始pH對產(chǎn)酸的影響Fig.4 Effect of initial pH value on Acid Production

從圖4可以看出：當(dāng)初始pH為6.5時，檸檬酸產(chǎn)量最高，說明偏酸的環(huán)境條件有利于酶的產(chǎn)生和分泌，同時有利于產(chǎn)物合成；對于通過發(fā)酵罐的液體發(fā)酵，當(dāng)初始pH低于5.0時，纖維素酶產(chǎn)生減少，致使纖維素不能很好的糖化，從而使營養(yǎng)物質(zhì)缺乏，生產(chǎn)緩慢，產(chǎn)酸能力弱。當(dāng)初始pH高于7.0時，黑曲霉的菌體容易自溶，并且容易導(dǎo)致菌體提早老化，產(chǎn)酶時間縮短，并且酶易失活，產(chǎn)酸能力下降，甚至不產(chǎn)酸。所以，當(dāng)初始pH為5.5～6.5范圍內(nèi)，有利于黑曲霉酶的產(chǎn)生和分泌，同時有利于產(chǎn)物的合成。

2.5 發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

通過單因素試驗，選擇碳源、氮源、表面活性劑和初始pH4個因素作為影響黑曲霉產(chǎn)酸培養(yǎng)基配比的主要因子，分別以不同濃度選擇3個水平，設(shè)計四因素三水平的L9（34）正交試驗。因素水平見表1，正交試驗結(jié)果見表2。

表1 因素水平表Table 1 Factor level table

表2 正交試驗結(jié)果Table 2 Results of orthogonal test

由K值看出發(fā)酵培養(yǎng)基最優(yōu)的配方為A3B2C2D3，正交8號A3B2C1D3檸檬酸產(chǎn)量最高為78.4 mg/mL，為了得到真正的最優(yōu)培養(yǎng)基配方，設(shè)計了驗證試驗。試驗結(jié)果表明，其他條件都一致的情況下，配方A3B2C2D3的檸檬酸產(chǎn)量為72.8 mg/mL，配方A3B2C1D3的檸檬酸產(chǎn)量為78.4 mg/mL。所以，最優(yōu)的發(fā)酵培養(yǎng)基配方應(yīng)為A3B2C1D3。

從表2可以看出：極差R計算結(jié)果表明，培養(yǎng)基中對檸檬酸產(chǎn)生影響的順序是：碳源＞初始pH＞表面活性劑＞氮源。驗證試驗結(jié)果表明，黑曲霉XSY0607的發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化配方為A3B2C1D3，即培養(yǎng)基中碳源6%、氮源5%、表面活性劑0.1%、初始pH 6.5。

3 結(jié)論

通過單因素試驗和正交試驗得出黑曲霉XSY0607利用纖維素發(fā)酵產(chǎn)生檸檬素，得到最優(yōu)的培養(yǎng)基的條件為A3B2C1D3，即培養(yǎng)基中碳源6%、氮源5%、表面活性劑0.1%、初始pH6.5。該試驗結(jié)果為黑曲霉XSY0607菌株利用纖維素作為原料發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸的工業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用提供了一定的參考。

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