基因芯片與液體快速培養(yǎng)技術(shù)診斷耐藥結(jié)核病的對比研究

楚麗香 孫波 姜春梅 閆宇 劉玉琴

基因芯片與液體快速培養(yǎng)技術(shù)診斷耐藥結(jié)核病的對比研究

楚麗香 孫波 姜春梅 閆宇 劉玉琴

目的對比研究基因芯片與液體快速培養(yǎng)技術(shù)診斷耐藥結(jié)核病的效果。方法 1156例疑似肺結(jié)核及肺結(jié)核患者的同一痰樣本, 同時應(yīng)用基因芯片技術(shù)(芯片組)與液體快速培養(yǎng)技術(shù)(快培組)進(jìn)行結(jié)核菌耐藥檢測, 對兩組檢測結(jié)果進(jìn)行對比分析。結(jié)果 對兩組實驗檢測結(jié)果進(jìn)行對比分析, 結(jié)核菌檢出率：芯片組270例, 陽性率為23.36%, 快培組237例, 陽性率為20.50%。結(jié)核菌耐藥結(jié)果：芯片組46例, 耐藥率為17.04%, 快培組43例, 耐藥率為18.14%, 比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。芯片組與快培組同時檢出結(jié)核菌陽性時, 二者耐藥符合率達(dá)80%。結(jié)論 基因芯片檢測結(jié)合聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)和反向雜交技術(shù)(RDB)診斷結(jié)核病及耐藥結(jié)核病, 具有簡便、快速、靈敏、準(zhǔn)確的特點, 及時檢出結(jié)核病及耐藥結(jié)核病, 指導(dǎo)臨床針對性制定個性化抗結(jié)核方案, 避免盲目制定抗結(jié)核方案而導(dǎo)致醫(yī)源性耐藥結(jié)核病的出現(xiàn), 真正有效控制結(jié)核病及耐藥結(jié)核病。

結(jié)核分枝桿菌；耐藥性；基因突變；基因芯片；反向雜交點技術(shù)

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 選取2013年5月～ 2014年9月在本院就診的1156例疑似肺結(jié)核或肺結(jié)核患者, 用同一痰樣本同時做結(jié)核分枝桿菌耐藥突變基因檢測與快速液體培養(yǎng)及藥敏檢測, 結(jié)核分枝桿菌利福平耐藥突變檢測試劑盒(基因芯片法)由亞能生物技術(shù)(深圳)有限公司生產(chǎn), PCR擴(kuò)增儀、分子雜交儀均由亞能生物技術(shù)(深圳)有限公司提供。

1.2 樣本制備 快速液體培養(yǎng)標(biāo)本參照《結(jié)核病診斷實驗室檢驗規(guī)程》［1］結(jié)核菌培養(yǎng)標(biāo)本處理方法處理后進(jìn)行培養(yǎng)和鑒定, 并進(jìn)行藥物敏感性實驗。耐藥突變基因檢測的樣本, NaOH消化, 100℃加熱10 min, 13000 r/min離心2 min, 上清液即為DNA模板。

1.3 基因芯片檢測 采用PCR進(jìn)行基因擴(kuò)增, 將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物加入裝有基因芯片的雜交管中, 并將混合物加熱至100℃變性10 min, 之后迅速放入分子雜交儀中進(jìn)行雜交反應(yīng), 再將完成雜交的芯片進(jìn)行洗膜、孵育、顯色等過程, 最后進(jìn)行結(jié)果判讀。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示, 采用t檢驗；計數(shù)資料采用χ2檢驗。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 快培組藥敏檢測結(jié)果 在1156例臨床痰樣本中, 共檢出結(jié)核分枝桿菌237株, 檢出陽性率為20.50%, 藥敏實驗結(jié)果表明其中43株為耐藥株, 耐藥率為18.14%。

2.2 芯片組檢測結(jié)果 在1156例臨床痰樣本中, 使用基因芯片共檢出結(jié)核分枝桿菌270例, 檢出陽性率為23.36%, 其中46例為耐藥結(jié)果, 耐藥率為17.04%。

2.3 基因芯片法與快速液體培養(yǎng)法的結(jié)果比較 芯片組與快培組的結(jié)核菌陽性檢出率和結(jié)核耐藥率比較, 差異無統(tǒng)計學(xué)意義(陽性率χ2=2.751, 耐藥率χ2=0.107, P＞0.05), 將兩組數(shù)據(jù)進(jìn)行臨床對比分析得出, 芯片組與快培組同時檢出結(jié)核菌陽性時, 二者耐藥符合率為80%。見表1。

表1 1156例患者的基因芯片檢測與快速液體培養(yǎng)陽性率及藥敏檢測結(jié)果比較［n(%)］

3 討論

傳統(tǒng)的結(jié)核菌羅氏培養(yǎng)技術(shù)需要3個月才能確定耐藥結(jié)核病, 其陽性率不到10%, 最近幾年開展的抗酸分枝桿菌液體快速培養(yǎng)技術(shù), 將檢測時限縮短至7～42 d, 但仍需要先做抗酸分枝桿菌培養(yǎng), 培養(yǎng)出抗酸分枝桿菌后再做藥敏檢測需要4～15 d, 共計11～57 d, 確定肺結(jié)核及耐藥結(jié)核病時限仍不能令人滿意, 且陽性率不超過25%, 臨床醫(yī)生拿不到實驗室依據(jù)確定耐藥結(jié)核病, 無法制定個性化抗結(jié)核治療方案, 以往的經(jīng)驗性抗結(jié)核方案并不能完全有效控制結(jié)核病［1,2］。

目前已知98%以上結(jié)核分枝桿菌利福平耐藥性與rpoB基因中一長約81bp片段所編碼的氨基酸突變有關(guān), 其基本機(jī)理為正常情況下利福平通過和由rpoB基因編碼的RNA聚合酶β亞基特異性結(jié)合, 來阻斷結(jié)核菌RNA的合成, 導(dǎo)致結(jié)核菌的死亡［3,4］。當(dāng)rpoB基因突變時利福平不能阻斷結(jié)核菌RNA的合成, 也就不能發(fā)揮作用。目前已知結(jié)核菌異煙肼耐藥性與katG、ahpC、inhA等基因突變有關(guān), 乙胺丁醇和鏈霉素的耐藥相關(guān)基因分別是embB、rpsL基因。

本實驗所采用的結(jié)核分枝桿菌耐藥突變基因芯片檢測,結(jié)合聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)和反向點雜交(RDB)技術(shù),根據(jù)結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv序列, 設(shè)計了覆蓋rpoB、katG、inhA、embB、rpsL等基因突變區(qū)的系列寡核甘酸探針,制作膜芯片, 檢測標(biāo)本中結(jié)核分枝桿菌基因突變情況, 從而確定結(jié)核分枝桿菌(MTB)是否存在對利福平、異煙肼、鏈霉素、乙胺丁醇4個抗結(jié)核一線藥物耐藥。

基因芯片技術(shù)對結(jié)核菌的檢出率高于液體快速培養(yǎng), 二者同時陽性者, 耐藥符合率80%, 原因是目前已經(jīng)確定的結(jié)核菌耐藥突變基因主要是上述幾種, 還有未被發(fā)現(xiàn)的基因突變, 或探針之外未能檢測到的基因突變, 另外就是痰標(biāo)本中的結(jié)核菌基因突變的位點不完全一致, 目前為止, 還沒有發(fā)現(xiàn)結(jié)核分桿菌耐藥突變基因檢測結(jié)果假陽性者, 基因芯片與結(jié)核菌液體快速培養(yǎng)技術(shù)及羅氏培養(yǎng)技術(shù)可以互補。

基因芯片技術(shù)具有快速、靈敏、準(zhǔn)確、高通量等特點,因此采用基因芯片法檢測結(jié)核分枝桿菌及其耐藥性, 比現(xiàn)有的快培方法更加符合臨床的需要。本檢測最大的優(yōu)勢在于檢測周期短, 自動化程度高, 能夠及時檢出結(jié)核病及耐藥結(jié)核病, 指導(dǎo)臨床針對性制定個性化抗結(jié)核方案, 避免盲目制定抗結(jié)核方案而導(dǎo)致醫(yī)源性耐藥結(jié)核病的出現(xiàn), 從而真正有效控制結(jié)核病及耐藥結(jié)核病。

本項研究實驗結(jié)果表明, 采用基因芯片技術(shù)與傳統(tǒng)的結(jié)核菌液體培養(yǎng)技術(shù)比較, 符合率很高。而且只需8 h就能得到結(jié)果, 同時獲得四種抗結(jié)核一線藥物的耐藥情況, 相較于傳統(tǒng)的結(jié)核菌液體培養(yǎng)動輒需要2～8周的時間, 大大縮短了藥敏檢測的時間, 有利于快速指導(dǎo)臨床治療方案。

［1］ 中國防癆協(xié)會基礎(chǔ)專業(yè)委員會.結(jié)核病診斷實驗室檢驗規(guī)程.北京:中國教育文化出版社, 2006:54, 56-57.

［2］ 唐神結(jié), 許紹發(fā), 李亮.耐藥結(jié)核病學(xué).北京:人民衛(wèi)生出版社, 2014:96-111.

［3］ 李芳芳, 方紅輝, 何林, 等.結(jié)核分枝桿菌耐藥基因rpoB、katG、inhA突變快速檢測方法研究.熱帶醫(yī)學(xué)雜志, 2005, 5(6): 743-746.

［4］ 單萬水, 吳馳, 陳心春, 等.基因芯片技術(shù)在結(jié)核分枝桿菌耐藥突變基因檢測中的應(yīng)用.國際檢驗醫(yī)學(xué)雜志, 2008, 29(11): 112-114.

10.14163/j.cnki.11-5547/r.2015.13.128

2014-12-25］

黑龍江省衛(wèi)生廳科研課題(項目編號：2013318)

157000 黑龍江省牡丹江市傳染病醫(yī)院(楚麗香孫波 姜春梅 閆宇)；黑龍江省結(jié)核病防治院(劉玉琴)