丹參水提物通過調(diào)節(jié)PI3K/Akt信號通路來抑制急性心肌缺氧缺血的傷害

張東濤 黃偉哲 陳喜珊

·實驗研究·

丹參水提物通過調(diào)節(jié)PI3K/Akt信號通路來抑制急性心肌缺氧缺血的傷害

張東濤 黃偉哲 陳喜珊

評估丹參水提物對急性心肌缺氧缺血的作用, 為臨床應(yīng)用提供一定實驗依據(jù)。建立大鼠急性心肌缺氧再灌注模型, 丹參水提物在模型建立前飼喂大鼠, 結(jié)果表明丹參水提物可明顯降低心肌缺氧大鼠的氧化傷害, 提高Akt蛋白的磷酸化和bcl-2/bax, 最終減輕心肌細(xì)胞的凋亡。作者認(rèn)為丹參水提物通過激活PI3K/Akt信號通路進(jìn)而調(diào)節(jié)下游凋亡蛋白從而發(fā)揮對急性心肌缺氧缺血的明顯保護(hù)作用。

心肌缺氧再灌注;丹參水提物;大鼠

丹參是唇形科植物丹參的干燥根和根莖。丹參是著名的傳統(tǒng)中藥, 具有抗氧化、改善微循環(huán)、防止血栓形成等多種功效［1］。丹參對心、肝、肺、腦等多種組織器官的缺血再灌注損傷具有明顯作用, 主要通過以下途徑：清除氧自由基,保護(hù)線粒體, 改善能量代謝［2,3］。本文通過丹參水提物處理心肌缺血再灌注大鼠來研究其心肌保護(hù)功能和機理。

1 材料與方法

1.1 材料 60只SD大鼠, 2月齡, 購自上海斯萊克實驗動物有限公司。丹參水提物為本試驗室制備。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及動物模型 60只大鼠分為五組, 每組12只。 I/R組：所有大鼠均采用全身麻醉, 以 3% 戊巴比妥鈉(1.5 ml/kg) 腹腔注射(i.p.) 麻醉, 并行氣管切開插管, 連接于小型動物呼吸機, 調(diào)節(jié)呼吸頻率為80～90次/min, 開胸暴露心臟,行心房插管, 并引流至儲血槽, 并向儲血槽內(nèi)吹入100%純氧, 同時暴露股動脈, 行股動脈插管, 通過蠕動泵引流儲血槽內(nèi)氧和血通過股動脈泵入體循環(huán)。體外循環(huán)建立后, 即用動脈夾行升主動脈阻斷。然后觀察心電圖 S-T 段變化, 阻斷30 min 后, 開放升主動脈。再灌注 2 h后, 斷頭取血并采集心臟。用于心肌梗死面積測定的大鼠心肌樣本在再灌注24 h后取下心臟。假手術(shù)組(sham)的所有大鼠不阻斷升主動脈。丹參水提物組(150或300 mg/kg)：在手術(shù)前15 d, 鼠被灌喂150或300 mg/kg的丹參水提物, 其余同I/R組。LY294002組:在再灌注前15 min, 鼠被給LY294002(0.3 mg/kg i.v.)(經(jīng)尾靜脈給藥), 其余同I/R組。

1.2.2 MDA和抗氧化酶活力測試 按照上海廣銳生物科技有限公司的試劑盒說明書的要求進(jìn)行丙二醛(MDA)和抗氧化酶活力的測定。

1.2.3 凋亡率(AI)測定 AI按文獻(xiàn)[4]的方法測定。

1.2.4 心肌組織勻漿中的bax、bcl-2、Akt、p-Akt的Western印跡法檢測 大鼠取心組織, 提取蛋白, 應(yīng)用Western印跡法進(jìn)行檢測分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS20.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示, 采用t檢驗；計數(shù)資料以率(%)表示, 采用χ2檢驗。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠心肌缺血后再灌注120 min后, I/R組大鼠MDA水平增加顯著而抗氧化酶活力顯著下降, 和假手術(shù)組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01), 丹參水提物低劑量組和高劑量組與I/ R組相比較MDA水平降低和抗氧化酶活力上升幅度差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01), 與I/R組相比較, LY294002能夠顯著降低丹參水提物對鼠心肌中氧化傷害的效果。見表1。

2.2 大鼠心肌缺血后再灌注120 min后, I/R組大鼠bax、AI水平增加顯著而bcl-2、bcl-2/bax水平顯著下降, 和假手術(shù)組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01), 丹參水提物低劑量組和高劑量組與I/R組相比較bax、AI水平降低和bcl-2、bcl-2/bax上升幅度差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01), LY294002可以減弱丹參水提物對鼠心肌凋亡蛋白的影響。見表2。

2.3 大鼠心肌缺血后再灌注120 min后, I/R組大鼠p-Akt水平增加, 和假手術(shù)組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01), 丹參水提物低劑量組和高劑量組與I/R組相比較p-Akt水平降低幅度差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01), LY294002能夠減低丹參水提物對鼠心肌p-Akt水平的提高, 各組鼠心肌Akt水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。見表3。

表1 各組鼠心肌中MDA水平和抗氧化酶活力比較

表1 各組鼠心肌中MDA水平和抗氧化酶活力比較

注：與假手術(shù)組比較,aP＜0.01；與I/R組比較,bP＜0.01

組別例數(shù)MDA超氧化物歧化酶CAT谷胱甘肽過氧化物酶假手術(shù)組122.13±0.28197.48±20.1481.39±9.56121.52±10.62 I/R組12 8.45±0.71a84.09±7.99a36.01±4.04a58.49±6.59a丹參水提物低劑量組12 6.27±0.54b137.11±11.35b55.36±6.38b 91.36±10.72b丹參水提物高劑量組12 3.66±0.31b178.38±15.24b73.52±7.77b131.75±14.38bLY294002組12 5.83±0.48b 149.5±13.32b48.24±5.49b86.47±9.11b

表2 各組鼠心肌中bax、bcl-2、bcl-2/bax水平和AI

表2 各組鼠心肌中bax、bcl-2、bcl-2/bax水平和AI

注：與假手術(shù)組比較,aP＜0.01；與I/R模型組比較,bP＜0.05,cP＜0.01

組別例數(shù)baxBcl-2Bcl-2/baxAI (%)假手術(shù)組120.21±0.020.66±0.073.14±0.29 9.54±0.85 I/R組12 0.73±0.06a0.28±0.03a0.38±0.04a89.45±7.88a丹參水提物低劑量組12 0.59±0.06b0.49±0.06c0.83±0.07c60.24±6.63c丹參水提物高劑量組12 0.43±0.25c0.63±0.05c1.47±0.16c24.72±3.06cLY294002組12 0.61±0.05c0.46±0.05c0.75±0.09c72.18±3.11c

表3 各組鼠心肌中p-Akt、Akt水平

表3 各組鼠心肌中p-Akt、Akt水平

注：與假手術(shù)組比較,aP＜0.01；與I/R 組比較,bP＜0.01

組別例數(shù)p-AktAkt假手術(shù)組120.94±0.090.58±0.06 I/R組12 0.15±0.01a0.61±0.07丹參水提物低劑量組12 0.41±0.05b0.59±0.05丹參水提物高劑量組12 0.88±0.07b0.63±0.07 LY294002組12 0.61±0.06b0.58±0.06

3 討論

心肌缺血再灌注損傷是缺血損傷的延續(xù)和擴(kuò)大, 是彼此獨立而相互聯(lián)系的病理生理過程。因此, 盡快解除機體缺血狀況, 對減輕因缺血造成的損傷性變化有著重要的臨床意義。合理應(yīng)用抗再灌注損傷藥物, 將大大降低再灌注損傷帶來的危害, 增強心肌細(xì)胞抗再灌注損傷的能力, 對缺血心肌具有一定的保護(hù)作用［5,6］。在心肌缺血再灌注開始前, 產(chǎn)生過多的活性氧自由基(ROS)是心肌缺血再灌注損傷發(fā)病機制的重要的環(huán)節(jié)。在再灌注開始的時間內(nèi), 通過有效清除大量的ROS、減輕ROS的細(xì)胞毒性損傷, 對于減輕心肌缺血再灌注損傷具有重要意義。PI3K/Akt信號通路可以影響其他信號通路的活性, 例如MAPK Erk1/2 信號通路［7］, 從而影響細(xì)胞的生物特性。本實驗發(fā)現(xiàn), 丹參水提物能夠提高磷酸化Akt的表達(dá), 同時提高bcl-2/bax的水平, 降低心肌細(xì)胞凋亡指數(shù),這一結(jié)果與Akt抑制劑LY294002的效果是一致的。這表明丹參水提物是通過激活PI3K/Akt信號通路進(jìn)而抑止下游的凋亡基因和清除自由基來實現(xiàn)降低心肌缺血再灌注誘導(dǎo)的傷害的。

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Salvia miltiorrhiza aqueous extract in suppression of damage from acute myocardial hypoxia and ischemia through regulation of PI3K/Akt signal pathway

ZHANG Dong-tao, HUANG Wei-zhe, CHEN Xi-shan.Department of Cardiovascular Medicine, The First Affiliated Hospital of Medical College of Shantou University, Shantou 515041, China

An evaluation was made on the effect by salvia miltiorrhiza aqueous extract for acute myocardial hypoxia and ischemia, in order to provide experimental reference for clinical application.Myocardial ischemia reperfusion model of rat was established, and salvia miltiorrhiza aqueous extract was given to rat for feed before model establishment.The results showed that salvia miltiorrhiza aqueous extract could obviously reduce oxidative damage in myocardial hypoxia rat.It could increase phosphorylation of Akt protein and bcl-2/bax, in order to reduce apoptosis of cardiac muscle cell.It could be concluded that salvia miltiorrhiza aqueous extract showed remarkably protective effect for acute myocardial hypoxia and ischemia by activating PI3K/Akt signal pathway for regulation downstream apoptin.

Myocardial ischemia reperfusion; Salvia miltiorrhiza aqueous extract; Rat

10.14163/j.cnki.11-5547/r.2015.13.209

2014-12-05］

515041 汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科(張東濤), 心胸外科(黃偉哲)；汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院心血管外科(陳喜珊)