流感丸中烏頭堿的限量檢查及HPLC含量測定方法的建立

劉高宏，魏立莉

甘肅省中醫(yī)院，甘肅 蘭州 730050

流感丸中烏頭堿的限量檢查及HPLC含量測定方法的建立

劉高宏，魏立莉

甘肅省中醫(yī)院，甘肅 蘭州 730050

目的：建立流感丸中烏頭堿的限量檢查及HPLC含量測定方法。方法：采用薄層色譜法對流感丸中烏頭堿進(jìn)行限量檢查；采用高效液相色譜法測定流感丸中烏頭堿的含量。結(jié)果：薄層色譜方法簡便、專屬性強(qiáng)，烏頭堿在8.0～20 μg/mL范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系，平均加樣回收率為98.85%(RSD%=1.43%)。結(jié)論：該法穩(wěn)定、快速、簡便，結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，可用于流感丸中烏頭堿的限量檢查及含量測定。

流感丸；烏頭堿；限量檢查；高效液相色譜法

流感丸是由訶子、亞大黃、木香、鐮形棘豆、酸藤果、角茴香、阿魏、榜嘎等制成的復(fù)方制劑，具有清熱解毒之功效。用于流行性感冒，主治流清涕，頭痛咳嗽，周身酸痛，高熱等癥。流感丸為藏族驗方，原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載于《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》(95年版藏藥第一冊)［1］。方中榜那和榜嘎為烏頭屬植物［2］，烏頭屬植物多含有烏頭堿，為了用藥的安全性，參照《中國藥典》2010版一部附子理中丸項下烏頭堿限量檢查［3］，對該制劑烏頭堿限量的檢查方法進(jìn)行研究，同時采用HPLC對流感丸中的烏頭堿進(jìn)行含量測定［4］。

1 材料

1.1 儀器LC-10A高效液相色譜儀，包括SPD-6AV紫外可見檢測器、C－R4A數(shù)據(jù)處理機(jī)(日本島津)；641旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(BüCHI瑞士)；HS-6150D型超聲波清洗儀(上海欽森實(shí)驗儀器有限公司)；SK-M2型サンプルミル粉碎器(日本)；AE-260 AE-240型電子天平(瑞士)；HHS21-8型電熱恒溫水浴鍋(常州諾基儀器有限公司)；CS101-30型電熱鼓風(fēng)干燥箱(北京環(huán)創(chuàng)科學(xué)儀器有限公司)；TGL-16G型高速臺式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)。

1.2 試藥流感丸(青海柴達(dá)木藥業(yè)科技有限公司，批號：20100102)；烏頭堿對照品(中國藥品生物制品檢定所提供，供含量測定用，批號：110798-200805)；甲醇為色譜純，水為重蒸餾水，并經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 烏頭堿限量檢查

2.1.1 溶液的制備

2.1.1.1 供試品溶液的制備 取本品6 g，研細(xì)，加氨試液3 mL，再加乙醚25 mL，放置過夜，濾過，殘渣加乙醚洗滌兩次，25 mL/次，濾過，合并上述濾液，低溫?fù)]干，殘渣加三氯甲烷10 mL使溶解，轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，用三氯甲烷洗滌容器2次，10 mL/次，洗液并入分液漏斗中，用0.05 mol/L硫酸溶液提取4次(20、10、10、10 mL)，合并酸液，加氨試液調(diào)節(jié)pH值至9，再用三氯甲烷提取3次(20、15、15 mL)，合并三氯甲烷液，低溫蒸干，殘渣加無水乙醇2 mL使溶解，作為供試品溶液。

2.1.1.2 烏頭堿對照品溶液的制備 取烏頭堿對照品適量，加無水乙醇制成每1 mL含1 mg的溶液。

2.1.1.3 不含榜那及榜嘎陰性對照溶液的制備 按處方比例及制備工藝，配制不含榜那、榜嘎的陰性對照品，并依照上述供試品溶液的制備方法制成陰性對照藥材溶液。

2.1.2 鑒別 吸附劑：硅膠G板。點(diǎn)樣量：對照品溶液3 μL和7 μL，供試品溶液10 μL。展開劑：甲苯-乙酸乙酯-二乙胺(7∶2∶0.5)。顯色劑：稀碘化鉍鉀試液。

2.1.3 限量檢查結(jié)果 日光下檢視，供試品色譜中，在與烏頭堿對照品色譜相應(yīng)的位置上出現(xiàn)的斑點(diǎn)大小介于對照品低標(biāo)與高標(biāo)斑點(diǎn)之間。查閱相關(guān)文獻(xiàn)，參照《中國藥典》一部制附子項下烏頭堿限量計［3］，以高標(biāo)為限度，規(guī)定供試品色譜中，在與烏頭堿對照品色譜相應(yīng)的位置上出現(xiàn)的斑點(diǎn)應(yīng)小于對照品斑點(diǎn)。經(jīng)多人多次重復(fù)操作結(jié)果穩(wěn)定，陰性無明顯干擾，見圖1。

圖1 流感丸中烏頭堿薄層色譜圖

2.1.4 樣品含量限度的確定 經(jīng)查閱相關(guān)文獻(xiàn)，參照《中國藥典》一部制附子項下烏頭堿限量計［3］，烏頭堿對照品濃度為2 mg/mL，點(diǎn)樣量為5 μL，烏頭堿量為10 μg，取樣量為20 g，樣品點(diǎn)樣量為6 μL，樣品定容為2 mL，最高服用量為15 g，由此算得附子一次最高服用量所含烏頭堿限度為2.5 mg。以此為據(jù)，本品烏頭堿對照品濃度為1 mg/mL，點(diǎn)樣量高標(biāo)7 μL，烏頭堿量為7 μg，樣品取樣量為6 g，點(diǎn)樣量為10 μL，樣品定容為2 mL，日用量為6 g，即烏頭堿日用量為1.4 mg。本品中含烏頭堿日用量低于附子的用量。

2.2 HPLC法測定流感丸中烏頭堿的含量

2.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，以甲醇-0.03 mol/L磷酸二氫鉀溶液-三乙胺(55∶45∶0.04)為流動相，流速1.0 mL/min，檢測波長240 nm。理論板數(shù)按烏頭堿峰計算應(yīng)不低于3 000［5］。

2.2.2 溶液的制備［6-11］

2.2.2.1 對照品溶液的制備 取烏頭堿對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每l mL含烏頭堿0.2 mg溶液，即得。

2.2.2.2 供試品溶液的制備 取其粉末約6 g，精密稱定，置錐形瓶中，加氨試液拌勻濕潤，加無水乙醚60 mL，靜置過夜，超聲處理30分鐘，過濾，濾渣用無水乙醚洗滌3次，20 mL/次，合并乙醚液，低溫?fù)]干，殘渣用流動相溶解，并定量轉(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜(0.45 μm)濾過，作為供試品溶液。

2.2.3 測定法 分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各20 μL，注入液相色譜儀，測定，即得。

2.2.4 線性關(guān)系考察 精密吸取烏頭堿對照品儲備液0.4、0.5、0.6、0.8、1.0 mL，置10 mL容量瓶中，用甲醇定容，搖勻，按“2.2.1”項色譜條件操作，以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，處理得到直線回歸方程：Y=6 999.6X+1 921.6，r=0.999 9，線性范圍為8.0～20.0 μg/mL。表明在此濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.5 精密度試驗 精密吸取烏頭堿對照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，20 μL/次，以“2.2.1”項下色譜條件測定，記錄色譜圖，峰面積的RSD=0.52%，表明儀器進(jìn)樣精密度較好。

2.2.6 重現(xiàn)性試驗 取同批流感丸，研細(xì)、混勻，取粉末6份，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，測定，記錄色譜圖，其RSD為1.22%，表明該方法重現(xiàn)性良好。

2.2.7 回收率試驗 采用加樣回收法，取已知含量的同批流感丸，研細(xì)，混勻，取粉末適量，精密稱定，精密加入低、中、高濃度的烏頭堿對照品溶液，每個比例制備3份樣品。按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，測定，記錄色譜圖，計算回收率，平均回收率為98.85%、RSD為1.43%，符合要求。

2.2.8 樣品測定 取10批流感丸，研細(xì)，混勻，取粉末適量，精密稱定，按“2.2.2”項方法制備供試品溶液，測定，計算10批樣品中烏頭堿的平均含量為0.13 mg/g，結(jié)果見表1、圖1。

表1 流感丸中烏頭堿的含量測定結(jié)果

圖1 流感丸中烏頭堿HPLC色譜圖

3 討論

本研究采用HPLC對流感丸中的烏頭堿進(jìn)行含量測定。該實(shí)驗方法簡便、靈敏、快速，結(jié)果較穩(wěn)定，可用于流感丸中烏頭堿的限量檢查及含量測定。

流感丸為藏族驗方，原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載于《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》(95年版藏藥第一冊)，其內(nèi)容簡單(只對藏菖蒲和小茴香兩味藥進(jìn)行薄層鑒別)，本研究對有毒性的烏頭堿進(jìn)行限量檢測，保障了用藥安全。

［1］ 中國衛(wèi)生部藥典委員會.中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)：藏藥(第一冊)［M］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，1995：330.

［2］ 青海省藏醫(yī)藥研究所，青海省藥品檢驗所.中國藏藥［M］.上海：上海科學(xué)技術(shù)出版社，1996：518.

［3］ 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部［M］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：792.

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Construction of Aconitine Limited Inspection and HPLC Determination Method in LiuGanWan

LIU Gaohong,WEI Lili
Gansu Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine,Lanzhou 730050,China

A

1004-6852(2016)11-0024-03

2015-11-24

劉高宏(1974—)，男，主管中藥師。研究方向：中藥炮制及鑒定。