肝脾舒對肝硬化大鼠內毒素血癥的影響

劉曉琳

肝脾舒對肝硬化大鼠內毒素血癥的影響

劉曉琳

目的 探討肝脾舒對肝硬化大鼠血漿內毒素是否有調節作用。方法 雄性SD大鼠36只,隨機分為正常組、模型組、肝脾舒組、杜秘克組, 每組9只。正常組：每日腹腔注射生理鹽水, 模型組：采用40%CCl4橄欖油溶液腹腔注射制備肝硬化模型, 肝脾舒組在此基礎上每日給予肝脾舒灌胃, 杜秘克組在模型組基礎上每日給予杜秘克灌胃。取血檢測血漿內毒素(LPS)水平。結果 3個月后模型組大鼠血漿內毒素水平較正常組升高(P＜0.05)；與模型組相比, 肝脾舒組血清內毒素水平降低(P＜0.05)。結論 肝脾舒對肝硬化大鼠血漿內毒素水平有調節作用。

四氯化碳；肝硬化；肝脾舒；內毒素

1 材料與方法

1.1 主要試劑

四氯化碳由成都科龍化工試劑廠生產, 批號：150508。

內毒素(lipopolysaccharide, LPS)試劑盒為南京建成科技有限公司的產品。

1.2 分組與處理

雄性SD大鼠, 36只, 清潔級, 體重(200±20)g, 購自中科院實驗動物中心, 飼養在上海中醫醫院實驗動物中心。所有動物在有恒溫、恒濕及晝夜光線變化的房間里飼養, 自由進食、進水, 適應性飼養一周后開始實驗。

造模：本實驗選用四氯化碳法造模 , 將大鼠按體重分數予以40%CCl4溶液腹腔注射 , 0.3 ml/100 g體重, 首劑加倍,隔日1次, 造模90 d形成肝硬化模型。

分組：將36只大鼠隨即分為4組, 正常組、模型組、肝脾舒組、杜秘克組, 每組9只。

給藥：各組在造模同時給藥, 肝脾舒組20 ml/kg灌胃,正常組、模型組則用同等容量的生理鹽水灌胃, 杜秘克組按每日0.01mg/kg體重灌胃, 各組連續給藥90 d, 自由飲水, 普通飼料喂養。

檢測指標：實驗90 d后, 即用烏拉坦(1.25 g/kg)行腹腔麻醉, 取血檢測血漿中內毒素水平, 取肝左葉于10%中性甲醛固定后行HE染色。

1.3 檢測方法 ①血清指標檢測 檢測血漿中內毒素水平 操作步驟按試劑盒說明書嚴格進行 采用723 型分光光度計檢測②肝、回腸組織HE染色 經甲醛固定后取肝組織及回腸組織石蠟包埋 切片脫蠟水化 常規HE染色后普通光鏡下觀察肝組織及回腸組織病理變化。

1.4 統計學方法 所有數據均采用SPSS16.0統計學軟件分析。多組間比較以均數±標準差 ( x-±s)表示, 采用單因素方差分析, 兩兩比較方差齊時用LSD-t法, 方差不齊時用Dunnett'sT3 法。P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 與正常組相比, 模型組血漿內毒素水平升高(P＜0.05),與模型組相比, 肝脾舒組血漿內毒素水平降低(P＜0.05), 而杜秘克組血漿內毒素水平與模型組相比, 雖有所降低, 但差異無統計學意義(P＞0.05)。各組大鼠血漿內毒素水平見表1。

表1 各組大鼠血漿中內毒素水平( x-±s)

2.2 肝組織HE染色結果 正常組大鼠肝組織結構完整、清晰, 肝小葉正常, 肝細胞排列規則成索狀, 在中央靜脈周圍呈放射狀分布, 肝血竇結構清晰, 無異常改變。肝細胞呈多邊形, 胞漿均勻, 細胞核形態正常；模型組大鼠肝組織結構松散、紊亂、有大量點狀壞死及灶狀壞死、肝索消失, 肝間質廣泛纖維組織增生, 將正常肝小葉分割成大小不等的肝細胞團(即假小葉形成)；肝脾舒組肝小葉結構受損, 少數肝細胞氣泡樣變性但僅偶見壞死細胞, 少量纖維組織增生, 但未見形成間隔；杜秘克組肝小葉結構被破壞, 部分肝細胞氣泡樣變性并伴有細胞壞死, 纖維組織增生, 但較少形成間隔。回腸HE染色顯示正常組大鼠腸絨毛排列整齊, 結構完整, 長短基本一致, 無絨毛倒伏、脫落現象。模型組大鼠腸絨毛縮短、表面長短不一、結構紊亂、大部分絨毛出現斷裂及壞死脫落、肌層增厚；肝脾舒組和杜秘克組腸絨毛局部變短、排列基本整齊、結構尚完整, 部分絨毛有脫落、倒伏情況好轉, 肌層增厚。

3 討論

肝硬化患者易發生全身各系統嚴重并發癥, 病死率高,臨床和實驗研究均充分證實了腸屏障功能障礙在肝硬化并發癥的發展中所起的關鍵作用［1-3］。肝硬化患者常伴有腸源性內毒素血癥( intestinal endotoxemia, IETM)［4］, 而腸黏膜屏障損傷是形成IETM的關鍵環節, 腸道黏膜下固有層含有大量的肥大細胞, 其活化脫粒可釋放大量炎性介質加重肝細胞損傷, 促進肝硬化的發展［5］。肝硬化腸道功能異常導致腔內細菌過度繁殖和內毒素的產生, 后者可進入體循環導致內毒素血癥, 內毒素可激活白細胞產生和釋放炎癥介質, 如白細胞介素-1(IL-1)、IL-6、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、IF-γ、一氧化氮(NO)諸如此類, 可引起循環衰竭和遠端器官衰竭,造成腸道和肝臟損傷的進一步加重, 并造成腸屏障功能-內毒素血癥-臟器循環衰竭的惡性循環［6,7］。

作者在長期的醫療實踐中, 充分把握肝臟生理病理特點,認為肝為將軍之官, 其病多實多熱, 脾為后天之本, 其病多虛多寒。結合現代醫學病因學, 肝硬化的病因多為HBV、HCV等各種病毒侵襲人體, 羈留體內, 長期不愈(HBV、HCV等屬中醫疫毒濕邪范疇)；或是長期飲酒；或是長期過食膏脂厚味等, 形成肝病多實證熱證的病理特點。王靈臺教授是全國有名的中西醫肝病專家, 作者曾有幸隨從臨證學習, 深受其學術影響。王老在“病證并重辨證論治”的學術思想引導下,早年即以清肝為主立法, 組方“清肝顆粒”治療急慢性肝病,臨床及實驗表明, 可顯著改善患者肝功能并抑制病毒復制［8］。肝與脾的關系, 是木與土的關系, 肝病實, 易乘脾犯胃, 造成脾虛。所以古張仲景有“見肝之病, 知肝傳脾, 當先實脾”的說法。脾虛的典型癥狀“納呆、腹脹、便溏”等亦是肝硬化患者的常見癥狀, 實際是和現代醫學腸道的功能密切相關的。所以作者秉承王老的學術影響, 以清肝實脾立法, 組方肝脾舒(GPS), 藥物組成：虎杖、生白術、枳實、當歸、廣郁金, 臨床靈活化裁, 隨證加減用于各型肝硬化患者, 均取得滿意療效, 不僅能緩解患者各種臨床癥狀, 改善各種生化免疫學指標, 還能有效防止肝性腦病、多臟器功能衰竭等并發癥的發生。還可以有效改善便秘患者腸道癥狀［9］, 真正起到“四季脾旺不受邪”的效果。而肝脾舒對肝硬化患者的腸道粘膜是否有保護作用其機制如何尚未可知, 本研究旨在從大鼠的腸道粘膜屏障這一角度入手, 探討肝脾舒對硬化肝的保護機制。

肝脾舒君藥虎杖, 主要有效成分為虎杖苷和白藜蘆醇和大黃素等。研究顯示, 虎杖提取物有抗內毒素作用［10］；白藜蘆醇［11］在重癥急性胰腺炎的發生中具有抗氧化作用 , 能抑制TNF-α的產生 , 抑制ICAM-1和VCAM-1的表達 , 大黃素可以促進腸道平滑肌的蠕動并能抗菌抗病毒, 從而發揮腸黏膜屏障的保護作用。由此, 對此方進行進一步的臨床和實驗研究, 勢在必行, 也是一件利國利民的好事。

本研究模型組肝臟的病理變化表明其肝臟已經形成了肝硬化。 模型組大鼠血漿內毒素水平較正常組顯著升高,說明模型組形成了IETM。而肝脾舒組與杜秘克組肝臟的病理變化較模型組均有不同程度減輕, 血漿內毒素水平也降低, 經統計, 肝脾舒組對血漿內毒素水平的降低有作用明顯(P＜0.05), 而杜秘克組血漿內毒素水平與模型組相比, 雖有所降低, 但差異無統計學意義(P＞0.05)。

肝臟受到損傷時肝臟Kupffer細胞功能減退, 腸道菌群失衡, 腸黏膜屏障損傷不能有效地阻止腸源性內毒素進入門靜脈, 腸道細菌及內毒素易位形成IETM, 加重肝損傷。本研究模型組大鼠回腸組織病理改變表明其腸黏膜機械屏障受到損傷, 而肝脾舒組和杜秘克組回腸組織的病理變化較模型組均有不同程度減輕。說明肝脾舒和杜秘克均能夠有效保護腸黏膜屏障, 但在對肝細胞的保護作用和內毒素血癥的改善方面, 肝脾舒組作用優于杜秘克組。

綜上所述, 肝脾舒對肝硬化大鼠腸粘膜屏障具有保護作用,這可能是其減輕大鼠肝硬化程度、延緩肝硬化進展的機制之一。

［1］ Ramos AR, Matte U, Goldani HA, et al.Intestinal permeability assessed by 51Cr-EDTA in rats with CCl4 - induced cirrhosis.Arq Gastroenterol, 2010, 47(2):188-192.

［2］ Scarpellini E, Valenza V, Gabrielli M, et al.Intestinal permeability in cirrhotic patients with and without spontaneous bacterial peritonitis: is the ring closed?Am J Gastroenterol, 2010, 105(2):323-327.

［3］ Lee S, Son SC, Han MJ, et al.Increased intestinal macromolecular permeability and urine nitrite excretion associated with liver cirrhosis with ascites.World J Gastroenterol, 2008 , 14(24):3884-3890.

［4］ Nolan JP.The role of intestinal endotoxin in liver injury: a long and evolving history.Hepatology, 2010 , 52(5):1829-1835.

［5］ Shen DZ.A target role for mast cell in the prevention and therapy of hepatic fibrosis.Med Hypotheses, 2008, 70(4):760-764.

［6］ Kalambokis G, Tsianos EV.Endotoxaemia in the pathogenesis of cytopenias in liver cirrhosis.Could oral antibiotics raise blood counts? Med Hypotheses, 2011, 76(1):105-109.

［7］ Cavasin MA, Semus H, Pitts K, et al.Acute effects of endothelin receptor antagonists on hepatic hemodynamics of cirrhotic and noncirrhotic rats.Can J Physiol Pharmacol, 2010, 88(6):636-643.

［8］ 王靈臺.王靈臺肝病論治經驗集.上海：上海科學技術出版社, 2009: 69-70.

［9］ 潘相學, 鄭昱.肝脾舒合劑治療肝熱脾虛型便秘型腸易激綜合征臨床觀察.上海中醫藥大學學報, 2012 (3):41-43.

［10］ 馬坤芳, 王德旺, 任勇.β-環糊精選擇性提取虎杖化學成分及體外抗內毒素活性研究.上海中醫藥雜志, 2008, 42(8):81-82.

［11］ 張磊, 沙煥臣, 馬清涌, 等.白藜蘆醇對大鼠重癥急性胰腺炎腸道屏障的保護作用.西安交通大學學報：醫學版, 2009, 30(1):10-14.

10.14163/j.cnki.11-5547/r.2015.09.212

2014-11-04］

200071 上海市中醫院消化科

潘相學