野生杏遺傳多樣性研究

努爾買買提，滿 莉，溫亞梅，肖洪興

(1.伊犁師范學院新疆維吾爾自治區教育廳普通高等學校天然產物化學與應用重點實驗室，新疆 伊寧 835000；2.東北師范大學生命科學學院，吉林 長春 130024；3.四平市環境保護監測站，吉林 四平 136000)

野生杏遺傳多樣性研究

努爾買買提1，滿 莉2，溫亞梅3，肖洪興2

(1.伊犁師范學院新疆維吾爾自治區教育廳普通高等學校天然產物化學與應用重點實驗室，新疆 伊寧 835000；2.東北師范大學生命科學學院，吉林 長春 130024；3.四平市環境保護監測站，吉林 四平 136000)

采用DNA測序技術對原產于我國新疆伊犁河谷地區的杏(ArmenicavulgarisLamarck)進行了群體樣本測序.對所獲得的野生杏單拷貝核基因Adh1序列進行了分析.結果表明：不同野杏居群的核苷酸多態性和單倍型多態性沒有顯著差異.Gapdh基因序列的分析顯示，各野生杏居群的核苷酸多態性和單倍型多態性相對較低，特別是鞏留縣核桃溝的野生杏居群，其核苷酸多態性和單倍型多態性均為0.此外，AMOVA分析結果表明，遺傳變異主要發生在居群內，而居群之間沒有明顯的遺傳分化.研究結果不僅揭示了野生杏居群的遺傳多樣性，而且為杏的遺傳資源研究保護提供了科學依據.

野生杏；遺傳多樣性；SNP

杏(ArmenicavulgarisLamarck)，薔薇科(Rosaceae)李亞科(Prunoideae)杏屬(Armeniaca)落葉喬木，我國各地均產，多數為栽培；華北、西北和華東地區種植較多，少數地區逸為野生，新疆各地均有栽培.杏原產中國新疆，在新疆伊犁一帶野生成為純林或與新疆野蘋果林混生.野生杏主要分布于在伊犁的北天山等區域，西起于霍城縣的大西溝、小西溝、果子溝，伊寧縣的匹里青溝和吉里格朗溝，并向東延伸至新源縣的鐵木爾勒克.[1]上述區域的南向山溝和山脈的西坡、東坡，由于陽光充足、雨水充沛，非常有利于野杏的生長.從垂直分布來看，新疆野杏主要分布在闊葉林帶的下半部，海拔950～1 400 m的低山帶山坡和河谷中.

野生杏具有抗寒、抗旱、耐貧瘠、適應性強、栽培容易等特點，是綠化荒山、保護農田、實行果糧間作的優良樹種.其果實的形狀、顏色、品質及抗旱特性，都比栽培杏具有更為豐富的遺傳多樣性.因此，加強對野生杏資源的搜集、保存與利用，對于擴大栽培杏的遺傳多樣性具有重要意義.

近年來，國內外關于杏種質資源的研究越來越多，于希志等[2]對新疆杏資源進行了系統考察，揭示了新疆杏的資源特點；王磊等[1]從分布區域、形態生理、生長特性等方面描述了新疆杏的多樣性；劉黎明等[3]對新疆野生杏生殖生態進行了初步的研究；呂英民等[4]應用同工酶進行了杏屬植物演化關系和分類的研究.同時，也有部分學者采用分子標記技術對新疆野生杏的遺傳多樣性進行了探討，如何天明等[5]利用簡單重復序列(simple sequence repeat，SSR)對伊犁河谷野生杏種群遺傳結構進行了分析.然而，以往對新疆野生杏遺傳多樣性的研究大多采用簡單重復序列(SSR)[6]、隨機擴增DNA多態性(randomly amplified polymorphic DNA，RAPD)[7]、 擴增片段長度多態性 (amplified restriction fragment polymorphism，AFLP)等分子標記，這些分子標記由于所攜帶的遺傳信息較少，有的穩定性不強，近年來逐漸開始被淘汰.

隨著基因組測序研究的發展，單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism，SNP)已成為生命科學中的研究熱點.它是繼RAPD和SSR等第一、二代分子標記技術之后的最新的一代分子標記，因其在基因組中分布廣泛、位點豐富、遺傳穩定、易實現等優點而被廣泛應用于遺傳多樣性、分子標記輔助育種、品種鑒定和種質資源管理的研究中.目前，在玉米(ZeamayL.)、大豆(Glycinemax)、小麥(TriticumaestivumL.)及其他植物物種中已經發現了大量的SNP.[8]然而，利用SNP分子標記對新疆野生杏的遺傳多樣性進行研究的報道較少.因此，本研究采用以PCR和DNA測序為基礎的SNP分子標記技術，對野生杏的遺傳多樣性和遺傳結構進行了初步研究，以期為野生杏資源的有效保護和科學利用提供一些理論支持，同時也為進一步開展新疆野杏的遺傳多樣性研究奠定基礎.

1 材料與方法

1.1 材料的收集與基因組DNA提取

研究材料采集于新疆伊犁河谷地區伊寧縣的阿吾贊、鞏留縣的核桃溝和霍城縣的大西溝(見圖1和表1).采用快捷型植物基因組提取試劑盒(康為世紀生物科技有限公司，北京)提取新疆野生杏的基因組DNA，具體步驟參考產品說明書.

圖1 樣品采集分布圖

表1 新疆野生杏居群的采樣地點

1.2 實驗方法

1.2.1 引物設計和PCR擴增

根據NCBI(National Center for Biotechnology Information)中公布的擬南芥的乙醇脫氫酶(alcohol dehydrogenase，Adh1)和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，Gapdh)的基因序列與杏屬的EST文庫進行比對，獲得杏屬的Adh1和Gapdh基因的EST序列.基于所獲得序列(Adh1基因序列號為CV046978，Gapdh基因序列號為CV044191)利用Primer Premier 5.0軟件設計引物(見表2).

表2 引物信息

實驗所用的PCR反應體系包括：10×Buffer(Mg2+plus)2.0 μL，dNTPs (10 mmol/L) 0.4 μL，正反引物(10 pmol/μL)均為0.5 μL，rTaq酶(1 U/μL) 0.2 μL，模板基因組DNA(50 ng/μL)2 μL，ddH2O 14.4 μL.擴增程序為：95℃預變性5 min，94℃變性30 s，54℃退火30 s，72℃延伸60 s，35個循環；72℃延伸10 min.4℃保存.擴增產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測.

1.2.2 PCR產物的連接、轉化與測序

將得到的PCR產物進行切膠回收后連接到pMD18-T載體(Takara)上，再將連接了目的片段的載體轉入大腸桿菌感受態JM109(Takara)內，置于無氨芐的LB液體培養基中搖床培養2 min；將菌液均勻涂在含有氨芐(AMP)的LB固體培養基中，37℃條件下培養12 min.挑取透明的單一菌落進行菌液PCR檢測.反應體系15 μL，反應程序為：95℃預變性5 min，94℃變性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸60 s，35個循環；最后72℃延伸10 min.4℃保存.選擇檢測為陽性菌落的菌液送到上海立菲生物技術有限公司測序.

1.3 數據分析

根據測序所獲得的數據，采用序列比對軟件Clustalx1.81[9]對Gapdh和Adh1基因進行序列的比對，然后利用Bioedit[10]編輯軟件進行人工調整和編輯.

遺傳多樣性分析主要采用DnaSP5.0[11]軟件進行統計，具體參數包括核苷酸多態性(Pi)、單倍型多態性(Hd)、多態位點數(s)和單倍型數目(h).同時，采用DnaSP5.0軟件對Gapdh和Adh1基因進行Tajima’sD分析.此外，采用Arlequin 3.1[12]軟件中的AMOVA分析遺傳變異在野杏居群中的分布情況，并根據Fst來探討群體間的遺傳分化程度.

2 結果與分析

2.1 遺傳多樣性檢測

我們對野生杏3個居群總共53個個體的Gapdh和Adh1基因進行了測序，一共獲得53條Gapdh基因序列；因為有些個體在Adh1基因序列上有不同拷貝，所以共有68條Adh1基因序列(見表3).其中，Adh1基因片段的長度大約在900 bp，與實驗中根據杏屬序列設計的引物所對應的片段長度相符.基于Adh1基因序列分析，野生杏居群的核苷酸多態性(Pi)較高，其范圍在0.024～0.025之間.此外，不同野生杏居群間的核苷酸多態性沒有明顯的差異.而基于Gapdh基因序列分析結果，野生杏居群的核苷酸多態性(Pi)較低，其范圍在0.000～0.003之間，其中鞏留居群序列核苷酸多態性為0.

Adh1基因序列的單倍型多態性(Hd)分析顯示，霍城縣大西溝野生杏居群的單倍型多態性最高(0.995)，其次是伊寧縣阿吾贊野生杏居群(0.989)，最低的是鞏留縣核桃溝野生杏居群(0.988).該結果與各居群的核苷酸多態性一致.Gapdh基因序列分析顯示，伊寧縣阿吾贊野生杏居群的單倍型多態性最高(0.988)，霍城縣大西溝野生杏居群次之，Hd值為0.702；鞏留縣核桃溝野生杏居群最小，單倍型多態性是0.000.結合核苷酸多態性和單倍型多態性可以看出，伊寧縣阿吾贊野生杏居群和霍城縣大西溝野生杏居群的遺傳多樣性較高，鞏留縣核桃溝野生杏居群的遺傳多樣性低于這兩個居群.此外，通過對比2個基因的結果，發現Adh1的核苷酸多態性和單倍型多態性都要明顯高于Gapdh基因(見表3).

表3 野生杏居群的遺傳多樣性

2.2 中性檢驗與AMOVA分析

Tajima’sD是用于檢驗分子進化過程中中性學說的一個統計參數.從物種水平上對野生杏居群的Adh1基因和Gapdh基因序列進行中性檢驗，結果(見表3)顯示，Adh1基因序列的Tajima’s D值不顯著(P>0.10)，說明該基因并未受到自然選擇.與此類似，Gapdh基因序列的分析結果顯示，除了鞏留縣核桃溝的野生杏居群外，另外2個居群的Tajima’sD為負值.負的D值表明含有比理論上更多的低頻率的突變位點[13].

此外，通過對這2個基因進行的AMOVA分子方差分析表明，遺傳變異主要發生在居群內，居群間變異很小(Adh1基因FST=-0.031 42，Gapdh基因FST=0.070 38)(見表4)，這說明這3個群體的遺傳分化較低.

表4 基于Adh1和Gapdh基因序列的分子變異分析

3 討論

3.1 野生杏群體的遺傳多樣性

原產新疆的杏是我國重要的野生果樹之一，因此已有眾多的學者對其遺傳多樣性進行了探討.何天明等[5]利用SSR分子標記技術對伊犁河谷野生杏種群的遺傳結構和多樣性進行了研究，發現野生杏種群保持較高的遺傳多樣性(多態性帶百分率P=82.4%，Shannon多樣性指數為0.428)；此外，苑兆和等[14]利用熒光AFLP標記技術對普通杏4個生態群(伊犁生態群、中亞生態群、歐洲生態群、華北生態群)的群體遺傳結構進行了研究，結果表明伊犁生態群(野生杏)具有較高的遺傳多樣性(P=43.59%，H=0.131，I=0.202).本研究基于SNP分子標記技術對野生杏的遺傳多樣性進行了分析，結果表明這3個野生杏居群的Adh1基因具有較高的單倍型多態性和核苷酸多態性.相對而言，Gapdh基因的分析結果卻顯示，這3個野生杏居群的單倍型多態性和核苷酸多態性較低.

3.2 野生杏群體的遺傳變異

根據AMOVA分子方差分析，野生杏群體的遺傳變異主要發生在居群內，居群間的遺傳變異很小.導致該現象的原因可能有2個：首先，各個居群間可能存在較大的基因流，從而阻止了居群之間的分化.已有的對野生杏的研究結果表明，野生杏居群間的遺傳距離與居群間的地理分布間隔具有相關性，這說明了地理距離相近的群體之間存在基因流.[5]其次，這些居群可能是最近才分化的.圖1顯示，霍城縣、鞏留縣分別位于新疆伊犁自治州的西北部和東南部，阿吾贊位于伊寧縣境內，處于中部，這種地理分布對野生杏的遺傳分化有著顯著的影響.

3.3 野生杏遺傳多樣性資源保護

高水平的遺傳多樣性是種群穩定的基礎.本研究中的野生杏居群保持了較高的遺傳多樣性，因此，對這些自然群體的保護是對野生杏種質資源保護的首要任務.此外，還可以考慮建立保護基地，建立核心種質基因庫，通過人工授粉等措施促進基因交流，最大限度地保持野生杏種群的遺傳多樣性.在進行遺傳多樣性保護和種質資源保存的同時，應充分重視居群內不同類型個體的保存，同時也要在分布區不同區域內保存不同的群體.[15]

[1] 王磊.新疆野蘋果和新疆野杏[J].新疆農業科學，1989(6):33-34.

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[3] 劉黎明.新疆野杏生殖生態初步研究[D].烏魯木齊:新疆農業大學，2010.

[4] 呂英民，呂增仁，高鎖柱.應用同工酶進行杏屬植物演化關系和分類的研究[J].華北農學報，1994，9(4):69-74.

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[14] 苑兆和，陳學森，張春雨，等.普通杏群體遺傳結構的熒光AFLP分析[J].園藝學報，2008(3):319-328.

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(責任編輯：方 林)

Genetic diversity of wild apricot (PrunusarmeniacaL.) in Xinjiang

NU ER Mai-mai-ti1，MAN Li2，WEN Ya-mei3，XIAO Hong-xing2

(1.Key Laboratory at Universities of Education Department of Xinjiang Uygur Autonomous Region，Yili Normal College，Yining 835000，China；2.School of Life Sciences，Northeast Normal University，Changchun 130024，China；3.Environmental Monitoring Station of Siping City，Siping，136000，China)

This study employed DNA sequencing technique to investigate the genetic diversity of three natural populations (AWZ，GONGLIU and HUOCHENG) of wild apricots (PrunusarmeniacaL.) distributing in Yili Valley，Xinjiang.According to the resulted sequences of Adh1 gene，the genetic population analyses showed that three natural populations of wild apricot possessed high levels of nucleotide and haplotype diversity.In contrast，the results of Gapdh revealed that relatively low nucleotide and haplotype diversity were found in the three populations.Specifically，no SNPs were identified in the population in GONGLIU.In addition，the analysis of AMOVA demonstrated that no significantly genetic differentiations were observed between the three populations.The findings provided framework for future studies of genetic conservation of wild apricots.

wild apricot；genetic diversity；SNP

1000-1832(2015)04-0111-05

10.16163/j.cnki.22-1123/n.2015.04.024

2014-04-02

自治區科技支疆項目(2014915)；新疆教育廳普通高等學校重點實驗室項目(2013YSHXYB08).

努爾買買提(1971—)，男，博士研究生，講師；通訊作者：肖洪興(1963—)，男，博士，教授，博士研究生導師，主要從事植物系統與進化研究.

Q 941+.2 [學科代碼] 180·5155

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