姜黃素亞型B14對HK Ⅱ細胞損傷的保護作用及機制

馬佳男，劉秋菊， 安 偉，程 飛，魏 巍

(1.吉林大學基礎醫學院，吉林 長春 130021；2.吉林大學第一醫院泌尿外科，吉林 長春 130021；3.吉林大學第一醫院腫瘤中心，吉林 長春 130021)

姜黃素亞型B14對HK Ⅱ細胞損傷的保護作用及機制

馬佳男1，2，劉秋菊3， 安 偉1，程 飛1，魏 巍1

(1.吉林大學基礎醫學院，吉林 長春 130021；2.吉林大學第一醫院泌尿外科，吉林 長春 130021；3.吉林大學第一醫院腫瘤中心，吉林 長春 130021)

采用CCK-8比色法檢測了姜黃素(Cur)及其亞型對人腎皮質近曲小管上皮細胞(HK Ⅱ)的損傷作用；采用ELISA法檢測了不同濃度和時間條件下血管緊張素Ⅱ(Angiotensin Ⅱ，Ang Ⅱ)對HK Ⅱ細胞Cleaved caspase-3表達的影響，并建立了糖尿病腎病細胞模型；利用此模型研究了B14對HK Ⅱ細胞的保護作用及機制.結果表明：Cur及其亞型B13，B14對HK Ⅱ細胞均無毒害作用；以Ang Ⅱ 250 nmol/L培養48 h時，可建立最佳糖尿病腎病模型.B14對Ang Ⅱ引起的HK Ⅱ細胞損傷具有保護作用，且此種保護作用與PI3K信號通路有關.

姜黃素亞型B14；血管緊張素Ⅱ；糖尿病腎病；人腎皮質近曲小管上皮細胞

糖尿病(diabetes mellitus，DM)是一種常見的代謝紊亂性疾病.25%～40% 的糖尿病患者最終發展為糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)，而糖尿病腎病常由糖尿病的微血管病變引起，是糖尿病最主要的微血管并發癥，也是導致終末期腎病(end-stage renal disease，ESRD)的首要原因.[1]

血管緊張素Ⅱ(Angiotensin Ⅱ，Ang Ⅱ)是已知最強的縮血管活性物質之一，它可引起血流動力學變化從而造成細胞損傷.研究發現，AngⅡ造成的細胞損傷是糖尿病腎病發生、發展的主要誘因之一[2].

姜黃素(curcumin，Cur)是從姜科植物姜黃中提取的一種植物多酚，具有抗感染、抗氧化及抗腫瘤等作用.近年來的研究發現，Cur對很多疾病引起的細胞損傷及纖維化有明顯的保護作用[3].陳麗等研究證實，Cur對糖尿病大鼠腎臟病變具有明顯的防治作用[4]；梁廣等以Cur為先導物，設計、合成了姜黃素結構類似物和衍生物，并對其活性進行了檢測，其中亞型B14有明顯的抗細胞凋亡及抗腫瘤活性.[5]

本實驗基于以上研究，探討了B14對AngⅡ誘導的人腎皮質近曲小管上皮細胞損傷的保護作用及機制，以為研究糖尿病腎病的發病機制和研制新型預防糖尿病腎病的藥物奠定實驗基礎.

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

人腎皮質近曲小管上皮細胞(HK Ⅱ)、姜黃素及其亞型B13和B14由美國路易斯威爾大學醫學中心饋贈.DMEM培養基和胎牛血清購自GIBCO公司；胰蛋白酶和青鏈霉素混合溶液購自北京鼎國生物技術有限公司；CCK-8試劑購自Beyotime公司；Cleaved caspase-3試劑盒購自細胞信號技術有限公司(Cell Signaling Technology Co.)；其他化學試劑均為國產分析純.

1.2 方法

1.2.1 細胞培養及傳代

將HK Ⅱ細胞用含10% 胎牛血清的DMEM培養基培養于37℃、含5%CO2的飽和濕度培養箱中，每2～3 d換液1次.當鏡下觀察細胞融合度達80%～90%時，進行細胞傳代.

1.2.2 Cur及B13，B14對HK Ⅱ細胞活性影響的檢測

將對數生長期的HK Ⅱ細胞調至 1×105個/mL后接種于3塊96孔培養板中，每孔100 μL，設空白組、Cur組、B13組、B14組4組，每組6個復孔，以調零孔進行調零比對.空白組只加培養液；給藥組分別加2.5 nmol/L的Cur及B13，B14.然后移至37℃、含5% CO2的飽和濕度培養箱孵育24，48，72 h.分別取出培養板，采用CCK-8法測定各孔D(450)值，計算細胞相對存活率.

細胞相對存活率=(D(450)給藥組-D(450)調零組)/(D(450)空白組-D(450)調零組)×100%.

1.2.3 DN模型的建立

將對數生長期的HK Ⅱ細胞調至 1×105個/mL后接種于96孔培養板中，每孔100 μL.依據文獻[5]，將100 nmol/L的Ang Ⅱ加入到培養基中進行培養，分別在不同的時間段取出，用ELISA法檢測細胞內Cleaved capase-3蛋白的表達情況，以確定最佳造模時間.然后，選取不同濃度的Ang Ⅱ加入到培養基中，按上述最佳造模時間培養后取出，用ELISA法檢測細胞內Cleaved capase-3蛋白的表達情況，以確定最佳給藥濃度.

1.2.4 B14對HK Ⅱ細胞損傷的保護作用及機制

將對數生長期的HK Ⅱ細胞調至4×105個/mL后接種于6孔培養板中，每孔加細胞懸液2 mL.然后移至37℃、含5% CO2的飽和濕度培養箱孵育.實驗分為5組：空白組不給任何藥物；Ang Ⅱ組添加最佳造模濃度的Ang Ⅱ；B13組、Cur組和B14組在添加最佳造模濃度的Ang Ⅱ的同時添加2.5 nmol/L的 B13，Cur和 B14.此外，另設5組，按上述各組給藥的同時再分別添加PI3K蛋白抑制劑.以上所有各組在培養最佳造模時間后，分別用ELISA法檢測細胞內Cleaved caspase-3蛋白的表達量，檢測方法參照試劑盒說明書.

1.2.5 統計學處理

采用SPSS15.0進行數據處理，各組實驗數據均用平均值±標準差表示.兩組間差異顯著性分析用兩樣本均數差別的t檢驗，P<0.05表示有顯著性差異，P<0.01表示有極顯著性差異.

2 結果

2.1 Cur及B13，B14對細胞活性的影響

圖1 Cur及B13，B14對HK Ⅱ細胞存活率的影響

如圖1所示，Cur及B13，B14在對HK Ⅱ細胞作用24，48，72 h時，細胞的存活率均大于97%，與空白組相比，無顯著性差異(P>0.05)，表明上述藥物對細胞無明顯毒害作用，可用于后續實驗研究.

2.2 DN模型結果

Cleaved caspase-3蛋白的表達變化是反映細胞凋亡程度的敏感指標，因此，測定細胞中Cleaved caspase-3蛋白的含量可判斷細胞損傷的程度.本實驗通過ELISA方法檢測了給予不同濃度AngⅡ、培養不同時間后細胞內Cleaved caspase-3蛋白的含量，結果如圖2、圖3所示.由圖2、圖3可見，當AngⅡ濃度為250 nmol/L，培養時間為48 h時，HK Ⅱ細胞Cleaved caspase-3的表達量較空白組顯著升高(P<0.05)，表明AngⅡ致HK Ⅱ細胞發生DN的最佳給藥濃度和時間分別為250 nmol/L和48 h.

2.3 B14對HK Ⅱ細胞損傷的保護作用

由圖4可見，AngⅡ組Cleaved caspase-3蛋白表達量明顯增加，即細胞凋亡明顯增加，與空白組相比差異極顯著(P<0.01)；而Cur組和B14組的Cleaved caspase-3蛋白表達量下降，細胞凋亡減少，與AngⅡ組相比差異顯著(P<0.05)，其中以B14組的細胞凋亡降低最為明顯(P<0.01)，而B13組Cleaved caspase-3蛋白表達量與模型組相比無明顯下降(P>0.05).這說明Cur及B14均對AngⅡ造成的HK Ⅱ細胞損傷有保護作用，且以B14效果最好.

*P<0.05(vs空白組)圖2 AngⅡ處理時間對HK Ⅱ細胞Cleaved caspase-3蛋白表達的影響

*P<0.05，**P<0.01(vs空白組)圖3 AngⅡ處理濃度對HK Ⅱ細胞Cleaved caspase-3表達的影響

**P<0.01(vs空白組)；#P<0.05，##P<0.01(vs AngⅡ組)圖4 ELISA法檢測各組HK Ⅱ細胞Cleaved caspase-3蛋白表達情況

*P<0.05(vs AngⅡ組)，#P<0.05(vs Cur+PI3K抑制劑組)，ΔP<0.05(vs B14+PI3K抑制劑組)圖5 PI3K抑制劑對HK Ⅱ細胞Cleaved caspase-3蛋白表達的影響

2.4 B14對HK Ⅱ細胞損傷保護作用的機制

由圖5可見，AngⅡ+PI3K抑制劑組Cleaved caspase-3蛋白表達量明顯升高，與AngⅡ組相比差異顯著(P<0.05)，說明PI3K信號通路的激活可抑制細胞凋亡；Cur+PI3K抑制劑組、B14+PI3K抑制劑組與Cur組、B14組相比Cleaved caspase-3表達量升高(P<0.05)，說明加入PI3K抑制劑后，Cur及B14 對細胞損傷的保護作用有所下降，即Cur及B14對HK Ⅱ損傷的保護作用機制與PI3K信號通路有關；而Cur+PI3K抑制劑組、B14+PI3K抑制劑組與AngⅡ組相比Cleaved caspase-3蛋白表達量仍下降(P<0.05)，說明加入PI3K抑制劑阻斷PI3K信號通路后，Cur及B14 仍對細胞損傷有保護作用，即Cur及B14對HK Ⅱ細胞損傷的保護作用還與其他信號通路有關.

3 討論

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是由糖代謝異常為主因所致的腎小球硬化，是糖尿病病人最重要的并發癥之一，其發病率在我國呈上升趨勢.目前，DN已成為終末期腎臟疾病的第二位，僅次于各種腎小球腎炎.由于DN存在復雜的代謝紊亂，一旦發展到終末期腎病，往往比其他腎臟疾病的治療更加困難，因此早期防治對延緩DN意義重大.研究發現，在DN中，Ang Ⅱ 可引起血流動力學變化，其介導細胞因子引起的細胞凋亡也越來越為人們所重視.[2]另外，Ang Ⅱ 受體拮抗劑也被發現并廣泛用于治療DN[7].因此，本實驗利用Ang Ⅱ制備腎小管上皮細胞DN模型，并通過檢測Cleaved caspase-3蛋白的表達確定最佳的造模濃度和時間，結果表明250 nmol/L的Ang Ⅱ 培養48 h可建立最佳的DN模型.

姜黃為常用中藥，具有行氣破瘀、通經止痛、清心解毒等功效，其主要生物活性成分為姜黃素類和揮發油.其中Cur具有降血脂、抗凝、抗氧化、利膽、抗癌等作用[3].已有研究證實[4]，Cur對Ⅱ型糖尿病腎病的大鼠腎臟具有保護作用.本實驗研究了Cur及其提取物B13，B14對腎臟的保護作用.結果發現，Cur及其提取物亞型B14均可不同程度地降低Cleaved caspase-3蛋白的表達，抑制細胞凋亡，其中以B14效果最好.表明B14對Ang Ⅱ引起的HK Ⅱ細胞損傷具有較Cur更強的保護作用.

PI3K-AKT-mTOR信號通路是細胞凋亡的重要信號通路，參與了不同種類細胞存活調節和抗凋亡的過程，其轉導過程的關鍵信號分子為PI3K蛋白.PI3K本身不但具有絲氨酸/蘇氨酸(Ser/Thr)激酶活性，也具有磷脂酰肌醇激酶的活性.當接受來自酪氨酸激酶和G蛋白偶聯受體信號后，可將刺激信號轉導到細胞內，促進細胞增殖和抑制細胞凋亡.[8]大量研究表明，PI3K/AKT可通過多種途徑發揮抗凋亡作用，被稱為經典的抗凋亡通路.[9]研究證實[10]，PI3K-AKT-mTOR是腎臟損傷過程中關鍵的信號通路.本實驗通過給予抑制PI3K-AKT-mTOR信號通路的抑制劑研究了B14對HK Ⅱ細胞損傷的保護作用機制，結果發現，加入PI3K抑制劑后，B14雖仍具有對HK Ⅱ細胞的保護作用，但這種保護作用的程度明顯下降，表明B14對HK Ⅱ細胞損傷的保護作用與激活PI3K-AKT-mTOR信號通路，進而抑制細胞凋亡有關，但并非唯一的作用途徑，有關的其他保護作用的機制還有待進一步研究.本實驗研究結果為今后DN藥物的治療提供了一個新的思路和方法.

[1] 盧葉，李海明. 基于指南之糖尿病腎病的診療[J]. 上海醫藥，2013， 34(18):6-9.

[2] OLEARCZYK J J，QUIGLEY J E，MITCHELL B C，et al. Administration of a substituted adamantyl urea inhibitor of soluble epoxide hydrolase protects the kidney from damage in hypertensive Goto-Kakizaki rats[J]. Clin Sci (Lond)，2009，116(1):61-70.

[3] CALABRESE V，BATES T E，MANCUSO C， et al. Curcumin and the cellular stress response in free radical-related diseases[J]. Mol Nutr Food Res，2008，52 (9):1062-1073.

[4] 陳麗，劉曉城. 姜黃素對糖尿病大鼠腎臟的保護作用及對血紅素加氧酶表達的影響[J]. 武漢大學學報(醫學版)，2009，30(1)：43-46.

[5] 梁廣，田吉來，郭麗麗. 姜黃素的構效關系及以其為先導物的抗腫瘤化合物研究進展[J]. 化學通報，2008(2)：110-118.

[6] 梁緒國，侯桂華，潘其興.血管緊張素Ⅱ 、卡托普利及氯沙坦對血管內皮細胞凋亡的影響[J].山東大學學報(醫學版)，2002，40(4):300-304.

[7] 潘道延，沈潔. 腎素-血管緊張素-醛固酮系統與糖尿病腎病[J].中華臨床醫師雜志，2015，9(4):523-527.

[8] YAN R，ZHANG Z M，FANG X Y，et al.Synthesis，molecular docking and biological evaluation of 1，3，4-oxadiazole derivatives as potential immunosuppressive agent[J].Bioorg Med Chem，2012，20 (4):1373-1379.

[9] 潘蓉蓉，金永喜，朱文宗. PI3K/Akt信號通路介導的細胞凋亡機制研究進展[J]. 浙江中西醫結合雜志，2013，23(1):70-71.

[10] XIE L，ZHENG X，QIN J，et al. Role of PI3-kinase/Akt signalling pathway in renal function and cell proliferation after renal ischaemia/reperfusion injury in mice[J]. Nephrology (Carlton)，2006，11(3):207-212.

(責任編輯：方 林)

The protective effect and mechanism of curcumin subtype B14 to HK Ⅱ injury

MA Jia-nan1，2，LIU Qiu-ju3，AN Wei1，CHENG Fei1，WEI Wei1

(1.The College of Basic Medical Sciences，Jilin University，Changchun 130021，China；2.Department of Urology，First Hospital of Jilin University，Changchun 130021，China；3.Department of Cancer Center，First Hospital of Jilin University，Changchun 130021，China)

The cell viability was detected with CCK-8 assay to observe toxic effects of curcumin(Cur) and its subtypes B13 or B14 on HK Ⅱ. Then，cleaved caspase-3 expression was detected with ELISA kit at different time and concentration of Angiotensin Ⅱ(Ang Ⅱ) in order to establish diabetic nephropathy cell model. Finally，the protective role and mechanism of Cur subtype B14 in the HK Ⅱ were researched with the cell model. The results showed that Cur and its subtypes B13 or B14 had no toxic effects on the HK Ⅱ cells. Diabetic nephropathy cell model could be established with 250 nmol/L Ang Ⅱ for 48 h. B14 can protect HK Ⅱ injury induced by Ang Ⅱ and this process could be associated with PI3K signaling pathway. This paper laid a foundation for researching the pathogenesis and developing new drugs of diabetic nephropathy.

curcumin subtype B14；Ang Ⅱ；diabetic nephropathy；HK Ⅱ

1000-1832(2015)04-0129-04

10.16163/j.cnki.22-1123/n.2015.04.027

2015-05-03

國家自然科學基金青年科學基金資助項目(81302860)；白求恩醫學科研支持計劃青年科研基金資助項目(2013205034).

馬佳男(1992—)，女，碩士研究生，主要從事泌尿外科基礎和臨床研究；通訊作者：魏巍(1975—)，男，博士，副教授，主要從事泌尿外科臨床研究.

R 692.6 [學科代碼] 320·2435

A