鳥結核分枝桿菌刺激巨噬細胞后對細胞骨架蛋白β-actin的調控機制研究

王建軍，王澤友，姚永良，吳建紅，成 陽，李光新

鳥結核分枝桿菌刺激巨噬細胞后對細胞骨架蛋白β-actin的調控機制研究

王建軍1，王澤友2，姚永良1，吳建紅1，成 陽1，李光新3

目的 研究鳥結核分枝桿菌刺激巨噬細胞后其對巨噬細胞骨架蛋白及其調節蛋白的作用機制。方法 RT-PCR方法分析M.avium刺激巨噬細胞后cofilin-1，β-actin基因的表達水平，同時Western blot方法從蛋白水平分析M.avium刺激巨噬細胞后β-actin、cofilin-1蛋白的表達水平。流式細胞術檢測M.avium刺激巨噬細胞后巨噬細胞凋亡及壞死的情況。結果β-actin基因及其蛋白在巨噬細胞受M.avium刺激后表達顯著下調，而β-actin蛋白的調節蛋白cofilin-1表達顯著增強。同時，M.avium刺激巨噬細胞后誘導巨噬細胞凋亡顯著增多。結論M.avium刺激巨噬細胞后可通過調控β-actin及cofilin-1蛋白的表達，從而誘導巨噬細胞凋亡或壞死。

巨噬細胞；鳥結核分枝桿菌；β-actin; cofilin-1

結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis, MTB)為結核病的病原菌，是兼性細胞內寄生菌，其引發的結核病被列為全球重大傳染病之一[1]。根據世界衛生組織的統計，我國是全球結核病流行嚴重的國家之一，結核病年發病人數約為130萬,占全球發病的14.3%，位居全球第2位[2]。

結核分枝桿菌感染人體后，主要被巨噬細胞吞噬，未被機體免疫系統清除而潛伏下來的MTB也主要寄生于巨噬細胞內，在巨噬細胞內增殖通過各種機制誘導細胞凋亡，發揮其抗結核活性[3]。肌動蛋白(actin)是微絲的結構成分，氨基酸結構高度保守，是構成細胞骨架的主要成分其表達水平的變化與細胞形態變化密切相關[4]。研究表明細胞凋亡時，肌動蛋白細絲發生斷裂，肌動蛋白網絡結構遭到破壞，這是細胞凋亡時形態改變的一個典型特征，提示肌動蛋白可能是細胞凋亡早期的調控物之一[5]。目前研究發現結核分枝桿菌感染巨噬細胞后巨噬細胞分泌的外泌體(exosomes)中的β-actin蛋白表達顯著下調及cofilin-1蛋白表達增強，表明結核分枝桿菌感染巨噬細胞可能改變宿主細胞骨架的穩定性[6]。鳥結核分枝桿菌是非結核分枝桿菌中重要的種屬之一，其不僅可引起淋巴結炎，淋巴結核，腦膜炎等，然而其導致的肺部病變與人型結核分枝桿菌導致的肺結核很相似。目前非結核分枝桿菌導致的疾病越來越受到衛生部門的重視，但非結核分枝桿菌的相關研究仍少之又少無法為臨床提供強有力的支撐。本文著重研究鳥結核分枝桿菌感染巨噬細胞后從基因與蛋白水平對細胞骨架蛋白及其調節蛋白進行研究，探討其在鳥結核分枝桿菌誘導細胞凋亡過程中發揮的具體機制。

1 材料與方法

1.1 研究對象 巨噬細胞系THP-1，鳥結核分枝桿菌(Mycobacteriumavium,M.avium)來購自上海物種保藏中心。

1.2 主要試劑 RPMI-1640培養基、胎牛血清購自Hyclone公司、RNA提取試劑、PCR試劑購自北京鼎國昌盛生物技術公司。β-actin、cofilin-1、GAPDH抗體購自上海義森生物科技有限公司。Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒購自上海前塵生物技術公司。

1.3M.avium培養 接種環取M.avium菌液于羅氏固體培養基上劃線接種，37 ℃培養4周后，刮下M.avium，0.05%吐溫無菌生理鹽水震蕩充分打散M.avium，高壓蒸汽滅菌使其喪失活性后比濁法計算M.avium菌液濃度(1.5 ×107/ mL)。

1.4 巨噬細胞培養 THP-1細胞于10%胎牛血清RPMl-l640培養基中，37 ℃ 5% CO2飽和濕度環境中培養48 h后，終濃度為1 μmol/L的佛波酯誘導細胞24 h使其分化成巨噬細胞后，隨機分為對照組與實驗組,對照組空白培養基刺激巨噬細胞；實驗組以滅活的M.avium刺激細胞24 h(M.avium：細胞=10∶1)。

1.5 RT-PCR引物設計及合成 根據NCBI數據庫檢索β-actin、GAPDH基因的cDNA序列并合成引物，引物序列如表1。

表1 β-actin及GAPDH引物序列

1.6 RNA提取 按照鼎國昌盛生物技術公司的Trizol試劑盒說明書提取細胞總RNA，-80 ℃保存備用。

1.7 RT-PCR 逆轉錄體系30 μL中含30 pmol/L oligo(dT)151 μL，2.5 mmmol/L dNTPs混合物4 μL，RNA酶抑制劑0.5 μL(30 U)，AMV逆轉錄酶0.5 μL(10 U)，5×RT緩沖液6 μL，1 μg模板RNA，17 μL DEPC水，37 ℃水浴1 h合成cDNA；25 μL PCR體系中含cDNA 2.5 μL，0.5 μL TaqDNA聚合酶1.5 U，10 mmol/L上游引物0.5 μL，10 mmol/L下游引物0.5 μL，2.5 mmol/L dNTPs 4 μL，10×PCR 緩沖液2.5 μL，無核糖核酸酶水14.5 μL，預變性94 ℃ 2 min，然后94℃變性30 s，53℃退火30 s，72℃延伸35 s，共30個循環，最后72 ℃延伸5 min，1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產物。

1.8 Western Blot 蛋白質提取試劑盒提取巨噬細胞受M.avium刺激前后的總蛋白并Bradford方法測定蛋白濃度；配制10% SDS-PGAE電泳膠，將變性后的蛋白質按50 μg的蛋白總量進行垂直電泳，然后通過電轉移法將蛋白質轉至PVDF膜上，β-actin抗體及cofilin-1抗體作為一抗，辣根過氧化物酶標記的二抗進行免疫反應。

1.9 細胞凋亡檢測M.avium刺激巨噬細胞24 h后，收集巨噬細胞1×106個，PBS(含2 g/L BSA)輕輕洗滌兩次；分別加入10 μL的FITC標記的Annexin-V抗體、PI試劑，重懸細胞室溫避光孵育30 min。PBS(含2 g/L BSA)洗滌細胞2次，0.4 mL PBS(含2 g/L BSA)重懸細胞，流式細胞儀檢測。

1.10 統計分析 所有數據均采用SPSS 16.0進行處理及統計學分析，兩組間比較采用t檢驗，多組間兩兩比較采用q檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1M.avium對巨噬細胞影響 THP-1細胞培養24 h后，無任何處理組為對照組，其余組以1 μmol/L TPA誘導分化形成巨噬細胞后以PBS、M.avium分別處理24 h，倒置顯微鏡觀察巨噬細胞生長形態 (圖1A)。同時，提取細胞基因組DNA、檢測基因組片段化情況(圖1B)。實驗結果表明巨噬細胞經M.avium刺激后，巨噬細胞形態未發生明顯變化，細胞基因組DNA未發生片段化。

a：THP-1細胞組；b：THP-1分化巨噬細胞組；c：M.avium處理巨噬細胞組。1：HindIII Marker；2：THP-1基因組DNA；3：巨噬細胞基因組DNA；4：巨噬細胞經M.avium刺激后的基因組DNA。

a: THP-1 cells group; b: THP-1 differentiated into macrophages group; c:M.aviumstimulation macrophages group. 1:HindIII Marker; 2: The gDNA of THP-1 cells; 3: The gDNA of macrophage cells; 4: The gDNA ofM.aviumstimulation macrophage.

圖1 巨噬細胞經M.avium刺激后的細胞形態(A)及基因組DNA分析(B)

Fig.1 Analysis of the morphology (A) and genomic DNA (B) ofM.aviumstimulation macrophages

2.2M.avium刺激巨噬細胞后β-actin及cofilin-1基因表達研究 巨噬細胞經M.avium處理24 h后，RT-PCR法檢測巨噬細胞β-actin及cofilin-1 mRNA的表達變化(圖2)，SPSS 16.0統計軟件分析β-actin及cofilin-1 mRNA表達水平，實驗結果表明β-actin基因在M.avium處理組表達下調2.3倍，差異有統計學意義(P<0.05)，而cofilin-1基因在M.avium處理組中表達增強1.3倍，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.3 Western blot分析細胞骨架蛋白 Western blot方法檢測M.avium處理巨噬細胞24 h后，巨噬細胞β-actin及cofilin-1蛋白的表達變化(圖3)。Image J灰度掃描灰度并經GAPDH灰度值校正后，SPSS 16.0統計分析，實驗結果表明M.avium刺激巨噬細胞24 h后巨噬細胞β-actin蛋白表達下調2.1倍，差異有統計學意義(P<0.05)，而β-actin的調節蛋白cofilin-1則表達增強1.7倍，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.5 流式細胞檢測巨噬細胞凋亡及壞死 巨噬細胞經M.avium感染處理24 h后，FITC標記Annexin-V抗體及PI試劑孵育細胞30 min后，流式細胞儀檢測各組細胞凋亡及壞死情況(圖4)。獨立進行3次重復實驗，SPSS 16.0對各組數據進行統計學分析，實驗結果表明M.avium感染巨噬細胞后處理巨噬細胞后，15%巨噬細胞發生凋亡，有統計學意義(P<0.05)；3%巨噬細胞發生壞死，有統計學意義(P<0.05)。

3 討 論

A：巨噬細胞受M.avium刺激后β-actin及cofilin-1 mRNA 的PCR結果；B：SPSS 16.0統計軟件分析結果，GAPDH為標準校正；(n=3與對照組相比，*P<0.05)。

A: Results ofβ-actinandcofilin-1 mRNA detected by PCR; B: Results of the expression ofβ-actinandcofilin-1 mRNA analyzed by SPSS 16.0 stastical software,GAPDHas a standard calibration (n=3, compared with the control group, *P<0.05).

圖2 RT-PCR方法分別檢測巨噬細胞受M.avium刺激后β-actin及cofilin-1 mRNA的表達水平

Fig.2 Expression ofβ-actinandcofilin-1 mRNA inM.aviumstimulation macrophages analyzed by PCR methods

巨噬細胞(Macrophage)是結核分枝桿菌在體內的主要宿主細胞，結核分枝桿菌可在巨噬細胞內長期滯留及潛伏[7]。結核分枝桿菌因其特殊的脂質結構而導致巨噬細胞內的溶酶體酶難以殺傷結核分枝桿菌，最終可導致結核分枝桿菌在巨噬細胞內大量增殖。結核分枝桿菌感染巨噬細胞后，將破壞宿主細胞骨架而導致細胞凋亡或壞死，繼而釋放結核分枝桿菌出胞而侵襲周邊巨噬細胞，并導致結核分枝桿菌感染加重。

結核分枝桿菌感染巨噬細胞后，巨噬細胞產生大量的TNF-α與IL-1β而增強caspase-3的活性，從而介導巨噬細胞凋亡，然而細胞的凋亡必然引起細胞骨架形態與成分的改變[8]。β-actin蛋白解聚與細胞凋亡關系密切，且其解聚常出現在凋亡小體形成前。胞漿肌動蛋白actin是細胞重要的骨架蛋白，細胞周期蛋白依賴性激酶-5調節亞基-1(Cyclin-dependent kinase 5, regulatory subunit 1, CD5R1)是細胞周期蛋白依賴性激酶-5(Cyclin-dependent kinase-5，CDK5)的特異性激活因子，活化的CDK5可促進tau蛋白過度磷酸化及過度表達，最終導致細胞骨架與微管的不穩定性[9]。Cofilin-1蛋白是細胞骨架蛋白的結合蛋白，其可通過水解ATP分解肌動蛋白纖維[10]。研究表明細胞凋亡時，肌動蛋白細絲發生斷裂，肌動蛋白網絡結構遭到破壞，提示肌動蛋白是細胞凋亡早期的調控物之一[11]。本研究前期發現巨噬細胞經鳥結核分枝桿菌刺激后分泌的exosomes中的actin蛋白表達顯著降低，而cofilin-1蛋白則表達顯著增強，表明巨噬細胞的細胞骨架可能受到鳥結核分枝桿菌的破壞而導致宿主細胞骨架相關蛋白的合成與加工受到抑制，同時actin與cofilin-1不一致的表達表明巨噬細胞在竭力調節并維持細胞骨架的穩定[12]。

A：M.avium處理巨噬細胞后β-actin與cofilin-1蛋白的表達結果。B：β-actin與cofilin-1蛋白表達經GAPDH校正后的統計分析結果，(n=3與對照組相比，*P<0.05)。

A: Results of the protein expression of β-actin and cofilin-1 in macrophages stimulated withM.avium. B: Results of the protein expression of β-actin, and cofilin-1 by stastical software, GAPDH as quantitative correction, (n=3, compared with the control group, *P<0.05).

圖3 Western blot分析巨噬細胞受M.avium刺激后β-actin蛋白及其調節蛋白cofilin-1的表達

Fig.3 Analysis of the expression of β-actin and its regulatory protein cofilin-1 inM.aviumstimulation macrophages by Western blot

本研究初步發現鳥結核分枝桿菌刺激巨噬細胞后細胞骨架蛋白受結核分枝桿菌的抑制，而誘導巨噬細胞大量的凋亡或壞死，提示鳥結核分枝桿菌可通過抑制細胞骨架蛋白的表達而誘導宿主細胞的凋亡，但具體的調節機制仍有待進一步研究。

A：流式細胞術檢測M.avium誘導巨噬細胞凋亡及壞死的水平；B：SPSS 16.0統計軟件分析巨噬細胞的凋亡及壞死結果(n=3與對照組相比，*P<0.05)。

A: The detection of the apoptosis or necrosis of macrophages infected withM.aviumby flow cytometry; B: Results of the apoptosis or necrosis of macrophages analyzed by SPSS 16.0 statistical software (n=3, compared with the control group, *P<0.05).

圖4 流式細胞術檢測巨噬細胞的凋亡及壞死情況

Fig.4 Analysis of the apoptosis or necrosis of macrophages by flow cytometry

[1]Ottenhoff TH, Doherty TM, van Dissel JT, et al. First in humans: a new molecularly defined vaccine shows excellent safety and strong induction of long-livedMycobacteriumtuberculosis-specific Th1-cell like responses[J]. Hum Vaccin, 2010, 6(12): 1007-1015. DOI: 10.4161/hv.6.12.13143

[2]Wang S, Yang AF. The present situation and the preventive measures of tuberculosis in China[J]. Chin J Ethnomed Ethnopharm, 2009, 18 (15): 65-66. (in Chinese) 王勝, 楊安芳. 我國結核病的現狀與預防措施[J]. 中國民族民間醫藥, 2009, 18 (15): 65-66.

[3]Dao DN, Kremer L, Guerardel Y, et al.Mycobacteriumtuberculosislipomannan induces apoptosis and interleukin-12 production in macrophages[J]. Infect lmmun, 2004, 72(4): 2067-2074. DOI:10.1128/IAI.72.4.2067-2074.2004

[4]Wu B, Ma J, Meng K, et al. Observation on ultrastructure of liver cell apoptosis[J]. J Chin Electron Microscopy, 2000, 19(6): 791-797. (in Chinese) 吳波, 馬捷, 孟奎, 等. 肝細胞凋亡的超微結構觀察[J]. 電子顯微學報, 2000, 19(6): 791-797.

[5]Franklin-Tong VE, Gourlay CW. A role for actin in regulating apoptosis/programmed cell death: evidence spanning yeast, plants and animals[J]. Biochem J, 2008, 413(3): 389-404. DOI: 10.1042/BJ20080320

[6]Wang JJ, Chen C, Xie PF, et al. Proteomic analysis and immune properties of exosomes shed by macrophages infected withmycobacteriumavium[J]. Microbes Infect, 2014, 16(4): 283-291. DOI: 10.1016/j.micinf.2013.12.001

[7]Siegel RM. Caspases at the crossroads of immune-cell life and death[J]. Nat Rev Immunol, 2006, 6(4): 308-317. DOI: 10.1038/nri1809

[8]Miao EA, Rajan JV, Aderem A. Caspase-1-induced pyroptotic cell death[J]. Immunol Rev, 2011, 243(1): 206-214. DOI: 10.1111/j.1600-065X.2011.01044.x

[9]Michaelis ML, Dobrowsky RT, Li G, et al. Tau neurofibrillary pathology and microtubule stability[J]. J Mol Neuro Sci, 2002, 19(3): 289-293. DOI: 10.1385/JMN:19:3:289

[10]Hotulainen P, Paunola E, Vartiainen MK, et al. Actin-depolymerizing factor and cofilin-1 play overlapping roles in promoting rapid F-actin depolymerization in mammalian nonmuscle cells[J]. Mol Biol Cell, 2005, 16(2): 649-664. DOI: 10.1091/mbc.E04-07-0555

[11]Franklin-Tong VE, Gourlay CW. A role for actin in regulating apoptosis/programmed cell death: evidence spanning yeast, plants and animals[J]. Biochem J. 2008, 413(3): 389-404. DOI: 10.1042/BJ20080320

[12]Wang JJ, Chen C, Tang LJ, et al. Molecular immune response of macrophages stimulated with exosomes secreted by macrophages infected withMycobacteriumtuberculosisand it’s proteomics analysis[J]. Chin J Cell Mol Immunol, 2012, 29(2): 123-126. (in Chinese) 王建軍, 陳偲, 湯立軍, 等. 鳥結核分枝桿菌感染巨噬細胞后分泌的外泌體刺激巨噬細胞產生的分子免疫反應及其蛋白質組學研究[J]. 細胞與分子免疫學雜志, 2012, 29(2):123-126.

Li Guang-xin, Email: lgxin34147@126.com

Regulatory mechanisms of the cytoskeletal protein β-actin after stimulation ofMycobacteriumaviumto macrophages

WANG Jian-jun1,WANG Ze-you2,YAO Yong-liang1,WU Jian-hong1,CHENG Yang1,LI Guang-xin3

(1.KunshanFirstPeople’sHospital,AffiliatedtoJiangsuUniversity,Kunshan215300,China; 2.InstituteofCancerResearch,CentralSouthUniversity,Changsha410078, 3.DepartmentofPathology,ChongqingCancerInstitute,Chongqing215300,China)

We investigated the functions of the cytoskeleton proteins and their regulatory proteins inMycobacteriumavium(M.avium) stimulation macrophages. The expression of β-actin and cofilin-1 were detected in mRNA and proteins levels by RT-PCR and Western blot technologies, respectively. Meanwhile, the apoptosis or necrosis of macrophages stimulated withM.aviumwas analyzed by flow cytometry. Results showed that β-actin mRNA and proteins of β-actin were both down-regulated inM.aviumstimulation macrophages, however the expression of cofilin-1 gene and proteisn was presented oppositely both in mRNA and protein level compared with the expression of β-actin. Furthermore, the apoptosis or necrosis of macrophages induced byM.aviumwas increased significantly. We confirmed that the expression of β-actin and confilin-1 could be regulated byM.aviumstimulation to induce theapoptosis or necrosis of macrophages.

macrophage;M.avium; β-actin; cofilin-1

10.3969/j.issn.1002-2694.2015.09.004

李光新, Email:lgxin34147@126.com

1.江蘇大學附屬昆山醫院, 昆山 215300; 2.中南大學腫瘤研究所,長沙 410078; 3.重慶市腫瘤研究所病理科,重慶 215300

Supported by the Science and Technology project of Kunshan social development(KS1425)

R392.11

A

1002-2694(2015)09-0800-05

2014-11-24；

2015-05-11

昆山市科技局立項項目(KS1425)