河南省2011-2013年小腸結腸炎耶爾森菌監測結果分析

穆玉姣,張白帆,李孟磊,趙嘉詠,景懷琦,夏勝利

河南省2011-2013年小腸結腸炎耶爾森菌監測結果分析

穆玉姣1,張白帆1,李孟磊1,趙嘉詠1,景懷琦2,夏勝利1

目的 了解河南省小腸結腸炎耶爾森菌的宿主分布、血清學及毒力基因情況。方法 于2011—2013年采集腹瀉病人糞便、各類家禽家畜糞便、蒼蠅以及生熟肉制品涂抹標本，共6 057份，采用冷增菌方法進行目的菌分離。對不同宿主樣本中分離到的小腸結腸炎耶爾森菌進行系統生化鑒定、血清學分型和毒力基因PCR檢測。結果 6 057份樣本中共分離出288株小腸結腸炎耶爾森菌，檢出率為4.75%。所分離的小腸結腸炎耶爾森菌主要血清型是O∶8和O∶5，生物分型以1A為主。O∶3血清型多具有致病性，其中以豬分離株最多。結論 河南省小腸結腸炎耶爾森菌在人群和各類動物中均有存在，豬是小腸結腸炎耶爾森菌致病性菌株的主要宿主。

小腸結腸炎耶爾森菌; 宿主；血清學分型; 毒力因子

小腸結腸炎耶爾森菌廣泛分布于自然界多種動物。家畜家禽帶菌率較高，人類與受感染的家禽家畜接觸,動物糞便污染水源、食品或者土壤等均可造成散發感染甚至疫情暴發。小腸結腸炎耶爾森菌是在冷藏溫度下生長的少數幾種腸道致病菌之一，冰箱中儲存的肉及肉制品也可能成為傳染源,造成小腸結腸炎耶爾森菌病的食源性傳播。

1 材料與方法

1.1 標本來源 2011-2013年河南省小腸結腸炎耶爾森菌監測點根據《全國小腸結腸炎耶爾森菌病監測方案》要求，在監測點鄭州、睢縣和登封采集腹瀉病人糞便、家禽家畜糞便、生熟食品等各類標本6 057份。

1.2 試劑與儀器 耶爾森菌選擇性培養基及配套抗生素為美國BD公司產品，0.1 mol/L磷酸鹽緩沖鹽水(pH7.4，改良PBS)、克氏雙糖鐵瓊脂(KIA)、動力吲哚尿素培養基(MIU)均購自上海市疾病預防控制中心，哥倫比亞營養瓊脂購自英國Oxoid公司。小腸結腸炎耶爾森菌分型血清購自日本生研株式會社 (包括O∶1,2、O∶3、O∶5、O∶8、O∶9),其它型別血清購自中國生物藥品鑒定所，菌株鑒定用API20E生化板條及配套試劑均系購自法國生物梅里埃公司，PCR擴增相關試劑及引物合成來自上海生工，PCR熱循環儀、電泳儀、凝膠成像儀均為美國Bio-Bad公司產品。

1.3 菌株分離培養 將采集的標本接種于10 mL改良PBS中,4 ℃冷增菌,分別于第7、14、21 d接種耶爾森菌選擇性培養基,25 ℃培養24～36 h,挑取疑似菌落轉種克氏雙糖斜面25 ℃培養24 h,選擇克氏雙糖+/-、不產氣、H2S-,接種于尿素培養基及半固體培養基,選擇尿素酶+、25 ℃培養動力+、37 ℃培養動力-,鏡檢為革蘭陰性桿菌或橢或球桿菌細菌者,使用Api 20E生化板條做系統生化鑒定。

1.4 血清學分型 生化反應是小腸結腸炎耶爾森菌鑒定的主要依據，同時還可以作為生物分型的依據，參照文獻[1] 。生化鑒定為小腸結腸炎耶爾森菌的菌株進行血清學分型，并設鹽水對照。

1.5 毒力相關基因檢測 PCR〔2〕檢測小腸結腸炎耶爾森菌粘附侵襲點基因(ail)、耐熱性腸毒素基因(ystA)、生物1A型攜帶的腸毒素基因(ystB)、粘附素(yadA )、yop調節子轉錄活化作用因子(virF)。PCR產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離(170 V， 30 min)。引物序列見表1。

表1 各檢測基因PCR擴增引物序列

2 結 果

2.1 標本檢出情況 共分離出288株小腸結腸炎耶爾森菌，檢出率為4.75%，分別分離自10種動物宿主中，其中豬源株所占比例最高為31.25%(90/288)，其次為雞源株27.08%(78/288)；其它依次為鴛鴦源株13.19%(38/288)，羊源株8.68%(25/288)，狗源株6.25%(18/288)，鴨源株5.21%(15/288)，腹瀉病人源株3.13%(9/288)，蒼蠅源株2.08%(6/288)，牛源株1.74%(5/288)，兔源株1.39%(4/288)。

2.2 菌株分型結果 對288株小腸結腸炎耶爾森菌進行了血清學和生物學分型。O∶8血清型菌株所占比例最高，為11.81%(34/288)，生物型全部為1A型； O∶5型為11.11%(32/288)，生物型全部為1A型；O∶3型為9.72%(28/288)，其中24株為3型生物型，4株為1A生物型。

2.3 95株已分型菌株在宿主中的分布情況 O∶3血清型是豬分離株的優勢型別，雞分離株的優勢血清型是O∶5和O∶8；大多數宿主分離株的生物分型以1A為主，其中狗、雞、牛、兔、鴨、羊、鴛鴦生物分型均為1A型；腹瀉患者、蒼蠅和豬分離株有3型生物型，其中豬分離株中50%為生物3型。見表2。

2.4 毒力基因檢測結果 對95株已分型菌株進行毒力基因ail、ystA、ystB、yadA 和virF檢測，結果見表3。ail+、ystA+、ystB-、yadA+、virF+或ail+、ystA+、ystB-、yadA-、virF-為致病菌，ail-、ystA-、yadA-、virF-為非致病菌株[4]。O∶3型菌株絕大多數為致病性菌株，部分O∶3型和全部的O∶5、O∶8、O∶9型為非致病菌株。

表2 菌株宿主-血清型分布情況(株)

表3 95株小腸結腸炎耶爾森菌的毒力基因分布情況

3 討 論

小腸結腸炎耶爾森菌在動物宿主中分布非常廣泛，尤其在是家禽家畜中，豬、雞、狗等可成為健康帶菌者。人與受感染的家禽家畜接觸，或接觸被感染動物糞便污染的水,食品，均可以造成感染。我們對2011-2013年河南省分離的288株小腸結腸炎耶爾森菌的宿主及其血清型,生物分型,致病性的檢測結果進行了分析，發現腹瀉病人、家禽家畜、昆蟲中均有分布，其中豬株源檢出率最高。

河南省主要流行的血清型是O∶5,O∶8，但這些菌株生物分型均為1A型且缺乏毒力因子[3]，說明河南省流行的O∶5和O∶8血清型不具有致病性，這與河南以往的監測結果一致[4]；但分析2例來源于人的血清型分別為O∶5和O∶8的菌株發現，其生物分型和毒力基因顯示不具有致病性，但病人有腹瀉等臨床表現，可能是毒力基因丟失或者是合并有其它致病菌感染，原因還有待進一步分析。大量實驗證明，致病性耶爾森菌遺傳背景復雜，染色體DNA指紋分析具有多態性[5]，因此區分有無致病性，不僅需要PCR技術，而且還需要生化鑒定,血清凝集實驗等輔佐。其次是O∶3血清型，通過對其生物分型,毒力基因及宿主的分析發現，我省分離出的28株O∶3血清型中有24株具有致病性。這24株致病菌株中，21株來源于豬，2株來源于蒼蠅，1株來源于腹瀉病人，說明豬是小腸結腸炎耶爾森菌致病性菌株的主要宿主。河南是生豬養殖大省，豬-人傳播存在很大的可能性，但動物致病株與人致病株的同源性，有待進一步研究。從蒼蠅中分離出致病性小腸結腸炎耶爾森菌，說明昆蟲在食物污染上起重要作用。

綜上，幾乎所有家禽中均有小腸結腸炎耶爾森菌自然感染的現象，但其是否具有致病性，需要生物化學,血清凝集和PCR多種實驗一起驗證。豬是致病性菌株重要的動物宿主[6]，需要加強豬群檢疫,衛生處理等工作。由于我國抗生素使用比較混亂，腹瀉病人在就診前大多已經服用過抗生素，致使從腹瀉病人中分離菌株較少，可能有未發現的感染病例存在。

[1]Wang H, Jing HQ, Zhu GC, et al.Yersiniaenterocolitica[M]. Beijing: People’s Publishing House, 2004: 16-18. (in Chinese) 汪華,景懷琦,朱鳳才,等.小腸結腸炎耶爾森氏菌[M].北京：北京人民出版社,2004：16-18.

[2]Thoerner P, Bin Kingombe CI, Bogli-Stuber K, et al. PCR detection of virulence genes inYersiniaenterocoliticaandYersiniapseudotuberculosisand investigation of virulence gene distribution[J]. Appl Environ Microbiol, 2003, 69: 1810-1816.

[3]Xiao YC, Wang X, Qiu HY, et al. Study of biotyping for pathogenicY.enterocoliticastrains in China[J]. Chin J Zoonoses, 2010, 26(7): 651-653. (in Chinese) 肖玉春，王鑫，邱海燕，等.中國致病性小腸結腸炎耶爾森菌生物分型研究[J].中國人獸共患病學報,2010.26(7)：651-653.

[4]Li ML, Mu YJ, Dang LC, et al. Surveillance analysis ofYersiniaenterocoliticain Henan Province from 2007 to 2010[J]. Chin J Zoonoses, 2013, 29(3): 312-315. (in Chinese) 李孟磊，穆玉姣，黨李成，等.河南省2007-2010年小腸結腸炎耶爾森菌監測分析[J].中國人獸共患病學報, 2013.29(3)：312-315.

[5]Huang Y, Jing HQ. Research ofYersiniainvasive[J]. Chin J Zoonoses, 2009, 25(7): 669-672. (in Chinese) 黃瑛，景懷琦. 耶爾森菌侵襲性研究進展[J].中國人獸共患病學報，2009,25(7)669-672.

[6]Liang J, Wang X, Xiao Y, et al. Prevalence ofYersiniaenterocoliticain pigs slaughtered in Chinese Abattoirs[J]. Appl Environ Microbiol, 2012, 78(8): 2949-2956.

Xia Sheng-li, Email: xiasl@hncdc.com.cn

Surveillance ofYersiniaenterocoliticain Henan Province from 2011 to 2013

MU Yu-jiao1,ZHANG Bai-fan1,LI Meng-lei1,ZHAO Jia-yong1,JING Huai-qi2,XIA Sheng-li1

(1.HenanProvincialCenterforDiseaseControlandPrevention,Zhengzhou450016,China; 2.InfectiousDiseaseControlandPrevention,ChineseCenterforDiseasePreventandControl,Beijing102206,China)

We investigated the distribution ofYersiniaenterocoliticain Henan Province. We collected 6 057 samples of stool specimen from diarrhea patients and different domestic animals between 2011 and 2013, as well as flies and the daub specimens of raw and cooked meat products. The bacteria were isolated by cold enrichment method, analyzed by the systematic biochemistery to determine the serotypes and bio-types, and tested the virulence genes by PCR method. As a result, 288 strains ofYersiniaenterocoliticawere detected in 6 057 specimens and the detection rate was 4.75%. The dominant epidemic serotypes of theYersiniaenterocoliticawere O∶8 and O∶5, type 1A was the dominant bio-type. The O∶3 type most have pathogenic and primary pathogenic strains were isolated from swine. In brief, the distribution of the host ofYersiniaenterocoliticawas widespread, while swine was the dominant animal host of athogenic strains.

Yersiniaenterocolitica; host; serotyping; virulence gene

10.3969/j.issn.1002-2694.2015.09.011

夏勝利，Email：xiasl@hncdc.com.cn

1.河南省疾病預防控制中心，鄭州 450016； 2.中國疾控中心傳染病預防控制所，北京 102206

Supported by a grant from the Major Special Project of Science and Technology Development (Nos. 2012ZX10004201 and 2012ZX10004203)

R378.2

A

1002-2694(2015)09-0835-04

2014-11-27；

2015-01-22

國家科技重大專項《艾滋病和病毒性肝炎等重大傳染病防治》(No.2012ZX10004201和No.2012ZX10004203)