結直腸腫瘤組織miR-215表達及臨床意義

婁杰，劉華，毛濤，丁雪麗，孔心涓，趙清喜

(青島大學附屬醫院消化內科，山東 青島 266003)

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·腫瘤專題·

結直腸腫瘤組織miR-215表達及臨床意義

婁杰，劉華，毛濤，丁雪麗，孔心涓，趙清喜

(青島大學附屬醫院消化內科，山東 青島 266003)

目的 研究microRNA-215(miR-215)在結直腸腫瘤組織和病人血清中的表達水平及其臨床意義。方法 從結直腸癌、結直腸腺瘤病人病變組織及健康查體者(正常對照組)結直腸組織和血清標本中提取微小RNA(microRNA)，應用實時熒光定量PCR(RT-qPCR)方法檢測miR-215的表達，分析miR-215表達水平與結直腸腫瘤臨床病理參數間的關系，并通過繪制受試者工作曲線(ROC曲線)探討血清miR-215在結直腸腫瘤診斷中的價值。結果 與正常對照組比較，miR-215在結直腸癌和結直腸腺瘤病變組織中表達顯著降低，差異有顯著性(F=16.603，t=5.756、3.572，P<0.01)；miR-215在結直腸癌和結直腸腺瘤病人血清中的表達也低于正常對照組，差異有顯著性(F=27.329，t=7.377、4.691，P<0.01)；與結直腸腺瘤組相比，結直腸癌組miR-215表達下調(t=2.182、2.671,P<0.05)。結直腸癌組織和病人血清中miR-215的低表達與病人的臨床分期有關(F=4.073、6.125，P<0.05)，且結直腸癌組織與血清中miR-215的表達量呈正相關(r=0.696,P<0.01)；miR-215表達與結直腸腺瘤臨床特征無關(P>0.05)。ROC曲線分析顯示，結直腸癌和正常對照組血清miR-215的ROC曲線下面積(AUC)為0.855(95%CI=0.740～0.970)，結直腸腺瘤與正常對照組血清miR-215的AUC為0.774(95%CI=0.634～0.913)。結論 miR-215在結直腸癌的早期診斷中具有潛在的價值。

結直腸腫瘤；聚合酶鏈反應；組織；血清；微RNAs

結直腸癌是我國常見的惡性腫瘤，在癌癥引起死亡的原因中占第4位，并呈上升趨勢。結直腸腺瘤是結直腸癌主要的癌前病變。結直腸癌早期癥狀不典型，大多數病人確診時已屬中晚期，目前雖有多種治療方法，如手術、放化療等，但預后均不理想[1]，因此，早期診治是提高病人預后的關鍵。目前，診斷結直腸癌的金標準為結腸鏡檢查及組織活檢，但二者均為侵入性檢查，暫時難以普及；而傳統血清腫瘤標記物如癌胚抗原(CEA)、糖類抗原19-9(CA19-9)等靈敏度及特異度低，因此限制了結直腸癌的早期診斷。微小RNA(microRNA)是一類內源性的非編碼RNA，在轉錄后水平調控基因表達，參與多種細胞過程[2]。研究已表明，腫瘤組織或外周血中多種microRNAs的表達異常與結直腸癌的發生發展有關[3-4]。microR-215(miR-215)是受P53誘導表達的一個microRNA,在腫瘤進展和轉移中起重要作用[5]。研究顯示，miR-215在胃癌高表達[6]，在腎癌低表達[7]，但其在結直腸癌表達的研究較少。本文檢測結直腸癌、結直腸腺瘤病人及正常對照者腫瘤組織和血清miR-215表達水平，分析其表達量與結直腸腫瘤臨床病理特征關系，探討血清miR-215檢測對結直腸癌早期診斷價值。

1 對象與方法

1.1研究對象

收集我院2014年4—8月診治結直腸癌病人46例、結直腸腺瘤病人38例及健康查體者(正常對照組)30例的結直腸組織和血液標本，病變組織診斷均經術后病理證實，血液標本均為術前獲得。結直腸癌46例中，男26例，女20例，年齡29～81歲，中位年齡65歲；按照美國癌癥聯合委員會(AJCC)-國際抗癌聯盟(UICC)聯合制定的TNM分期系統進行臨床分期；所有病人術前均未接受放化療或免疫治療等，且無其他部位腫瘤史。結直腸腺瘤38例中，男20例，女18例，年齡31～82歲，中位年齡63歲。正常對照組男16例，女14例，年齡29～79歲，中位年齡62歲；其結腸鏡、CT等檢查陰性，CEA、CA19-9等指標未見異常，無腫瘤病史。

1.2方法

1.2.1標本處理 采集組織標本后立即放至液氮中，然后置于-80 ℃冰箱凍存待用。收集待檢者外周血2 mL，于室溫靜置30 min，然后于4 ℃離心機以2 675 r/min和8 459 r/min分別離心10 min，吸取上清至新離心管中，置于-80 ℃冰箱保存備用。

1.2.2細胞總RNA提取 稱取約100 mg組織，吸取200 μL血清于離心管中，應用常規TRIzol試劑提取總RNA，分光光度計檢測RNA溶液的A260/280比值，取A260/280為1.8～2.1者進一步實驗。

1.2.3cDNA的合成以及實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測 取上述提取RNA 1 μL，按照SYBR?PrimeScriptTMmiRNA RT-PCR Kit(TaKaRa)試劑說明書將其逆轉錄為cDNA，然后取逆轉錄產物在LightCycler Real Time PCR擴增儀上進行RT-PCR反應，反應均設3個復孔，并設不加模板cDNA的反應管作為陰性對照。計算各管Ct值，以U6作為內參，以2-△CT表示miR-215的相對表達量。

1.3統計學方法

應用SPSS 18.0軟件進行數據分析,計量資料比較采用單因素方差分析(ANOVA)，兩兩比較應用Bonferroni法；應用Pearson相關性檢驗進行相關性分析，受試者工作曲線(ROC曲線)評估血清miR-215在結直腸腫瘤診斷中的價值；以P<0.05為差異有顯著性。

2 結 果

2.1各組結直腸腫瘤組織及血清中miR-215的表達水平比較

與正常對照組比較，結直腸癌組和結直腸腺瘤組病變組織中miR-215表達顯著降低(F=16.603,t=5.756、3.572，P<0.01)，其對應病人血清中miR-215的表達水平也顯著降低(F=27.329，t=7.377、4.691，P<0.01)；與結直腸腺瘤組比較，結直腸癌組病變組織和病人血清中miR-215表達均下降(t=2.182、2.671,P<0.05)。見表1。

2.2miR-215表達與腫瘤臨床病理參數的關系

結直腸癌組織和病人血清中miR-215表達下降與腫瘤的臨床分期有關，腫瘤分期越晚，miR-215表達下降越顯著(F=4.073、6.125，P<0.05)，而與性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤大小、腫瘤細胞分化程度、有無淋巴結轉移及CEA水平無關(P>0.05)。見表2。結直腸腺瘤組織和病人血清中miR-215的低表達與結直腸腺瘤的臨床病理特征均無關(P>0.05)。見表3。

2.3結直腸癌組織和血清miR-215表達相關性

結直腸癌組織與對應病人血清中miR-215表達量存在明顯相關性(r=0.696,P<0.01)。

2.4血清miR-215診斷結直腸腫瘤的效能

ROC曲線分析結果顯示，miR-215鑒別結直腸癌與正常對照組、結直腸腺瘤與正常對照組的ROC曲線下面積(AUC)分別為0.855(95%CI=0.740～0.970)和0.774(95%CI=0.634～0.913)。當最佳截斷值為0.347 3和0.318 8時，其診斷的靈敏度和特異度分別為72.2%、77.8%和86.1%、78.6%。見圖1。

3 討 論

近年來，大量研究顯示，miRNA與多種腫瘤的發生發展有密切的關系[8-9]。由于miRNA表達穩定，其在腫瘤的診斷、預后評價及療效評估方面有潛在的價值[10]。miR-215通過調控細胞周期檢驗點蛋白的表達，可能起抑癌基因的作用[5]。miR-215與腫瘤關系密切，已有研究顯示，其在腎癌、食管癌等腫瘤組織中表達下調[7,11]。KARAAYVAZ等[12]應用熒光定量PCR檢測組織中miR-215的表達，結果顯示，結腸癌組織中miR-215表達較正常降低，且miR-215表達水平與結腸癌病人的預后有關，提示miR-215可能作為結腸癌新的標志物和預后觀察指標。目前報道多研究癌及其癌旁組織中miR-215的表達，且研究較少，關于miR-215在結直腸腺瘤病人血清中的表達情況目前尚不明確。

表2 miR-215表達與結直腸癌臨床病理參數的關系

表3 miR-215表達與結直腸腺瘤臨床病理參數的關系

a：結直腸癌與對照組；b：結直腸腺瘤與對照組。

本研究應用RT-qPCR檢測結直腸癌組織和病人血清中miR-215的表達水平，結果顯示，與正常對照組比較，miR-215在結直腸癌組織和病人血清中表達下調，差異有顯著性。與吳旭波等[13]的研究結果一致。CHIANG等[14]檢測107例結直腸癌組織及其癌旁正常組織中miRNA的表達，結果顯示，miR-215在癌組織中的低表達與腫瘤大小有關，腫瘤體積越大，miR-215下降越明顯。本研究對結直腸癌組織和病人血清中miR-215表達水平與臨床病理參數分析結果顯示，miR-215低表達與腫瘤的臨床分期有關，這與FALTEJSKOVA等[15]的結果一致，提示miR-215可能在腫瘤細胞浸潤中發揮重要作用。另外，本研究同時檢測miR-215在結直腸腺瘤組織及病人血清中的表達情況，結果顯示，腺瘤組織和病人血清中miR-215也呈現低表達，但未發現其表達與臨床特征(年齡、性別、部位、腺瘤大小、病理類型等)有關，可能與樣本量不足有關。根據本研究結果，miR-215在結直腸腺瘤、結直腸癌中的表達較正常對照組依次下調，推測miR-215可能在結直腸癌早期病變中即發揮作用，結果有待更大樣本的研究證實。

目前，診斷結直腸癌的傳統血清腫瘤標記物靈敏度及特異度低[16]，限制了其早期診斷。本研究應用ROC曲線對miR-215的診斷效能進行評估，結果顯示，血清miR-215鑒別結直腸癌的靈敏度為72.2%，特異度為77.8%；鑒別結直腸腺瘤的靈敏度為86.1%，特異度為78.6%，提示miR-215對結直腸腫瘤診斷有一定價值。同時，本文結果還顯示，結直腸癌組織和病人血清中miR-215的表達具有相關性，提示有可能通過檢測血清miR-215水平來區分結直腸癌和結直腸腺瘤病人，這使得miR-215的血液檢測成為可能。隨著對血清miRNA在腫瘤中異常表達研究的深入，對血清中miRNA出現機制的進一步闡明，血清miRNA有望成為結直腸癌早期篩查的非侵入性手段之一。

同時，該研究存在一定的局限性，如標本取自同一地區、人群，且總樣本量不足等。雖然對結直腸腫瘤發展的不同階段中miRNA-215的表達進行了研究，但血清miR-215的異常表達是否與實體腫瘤自身有關，還是疾病進展過程中宿主免疫應答的表現，這仍存在疑問，若能對結直腸癌和結直腸腺瘤病人術后7 d血清標本進行檢測，而且術后病人血清中miR-215的表達升高，將進一步證明血清miRNA在結直腸腫瘤診斷中的價值。

綜上所述，miR-215在結直腸腫瘤組織和病人血清中低表達，其在結直腸腫瘤的診斷中具有潛在的價值，但將其應用于臨床，仍需進一步大規模的研究證實。

[1] CUNNINGHAM D, ATKIN W, LENZ H J, et al. Colorectal cancer[J]. Lancet, 2010,375(9719):1030-1047.

[2] TANG F C. Small RNAs in mammalian germline: tiny for immortal[J]. Differentiation; Research in Biological Diversity, 2010,79(3):141-146.

[3] XIONG Y, ZHANG Y Y, WU Y Y, et al. Correlation ofover-expressions of miR-21 and Notch-1 in human colorectal cancer with clinical stages[J]. Life Sciences, 2014,106(1/2):19-24.

[4] HUANG Z H, HUANG D, NI S J, et al. Plasma microRNAs are promising novel biomarkers for early detection of colorectal cancer[J]. International Journal of Cancer. Journal International du Cancer, 2010,127(1):118-126.

[5] BRAUN C J, ZHANG X, SAVELYEVA I, et al. p53-Responsive microRNAs 192 and 215 are capable of inducing cell cycle arrest[J]. Cancer Research, 2008,68(24):10094-10104.

[6] CHIANG Y, ZHOU X, WANG Z N, et al. Expression levels of microRNA-192 and-215 in gastric carcinoma[J]. Pathology Oncology Research: POR, 2012,18(3):585-591.

[7] WHITE N M, KHELLA H W, GRIGULL J, et al. miRNA profiling in metastatic renal cell carcinoma reveals a tumour-suppressor effect for miR-215[J]. British Journal of Cancer, 2011,105(11):1741-1749.

[8] 王虹,吳琍,侯琳,等. 家族性乳癌病人乳癌組織及血清miRNA-26a、143與195表達及意義[J]. 齊魯醫學雜志, 2015,30(4):379-382.

[9] 張騰龍,張鵬,孟月生,等. 多發性骨髓瘤組織微小RNA-19表達及其臨床意義[J]. 齊魯醫學雜志, 2013,28(1):14-16.

[10]ZHAI H Y, JU J F. Implications of microRNAs in colorectal cancer development, diagnosis, prognosis, and therapeutics[J]. Frontiers in Genetics, 2011,2(78):1-11.

[11]WIJNHOVEN B P, HUSSEY D J, WATSON D I, et al. MicroRNA profiling of Barrett's oesophagus and oesophageal adenocarcinoma[J]. The British Journal of Surgery, 2010,97(6):853-861.

[12]KARAAYVAZ M, PAL T, SONG Bo, et al. Prognostic significance of miR-215 in colon cancer[J]. Clinical Colorectal Cancer, 2011,10(4):340-347.

[13]吳旭波,曹奕鷗,浦文蘭,等. miR-215在進展期結腸直腸癌中的表達及其臨床意義[J]. 外科理論與實踐, 2013,18(3):247-251.

[14]CHIANG Y, SONG Y X, WANG Z N, et al. microRNA-192,-194 and-215 are frequently downregulated in colorectal cancer[J]. Experimental and Therapeutic Medicine, 2012,3(3):560-566.

[15]FALTEJSKOVA P, SVOBODA M, SRUTOVA K, et al. Identification and functional screening of microRNAs highly deregulated in colorectal cancer[J]. Journal of Cellular and Molecular Medicine, 2012,16(11):2655-2666.

[16]KIM H J, YU M H, KIM H, et al. Noninvasive molecular biomarkers for the detection of colorectal cancer[J]. BMB Reports, 2008,41(10):685-692.

(本文編輯 黃建鄉)

THE EXPRESSION OF MIR-215 IN COLORECTAL NEOPLASMS AND ITS CLINICAL SIGNIFICANCE

LOUJie,LIUHua,MAOTao,DINGXueli,KONGXinjuan,ZHAOQingxi

(Department of Gastroenterology, The Affiliated Hospital of Qingdao University, Qingdao 266003, China)

ObjectiveTo explore miR-215 expression in tumor tissues and in serum in patients with colorectal neoplasms and its clinical significance.MethodsMicroRNA was extracted from tissues of colorectal cancer, colorectal adenoma and healthy individuals who came for medical examination. The expression of miR-215 was detected using quantitative real-time polymerase chain reaction (RT-qPCR). The relationship between the level of miR-215 expression and clinicopathological parameters in colorectal neoplasms was analyzed, and the value of serum miR-215 in the diagnosis of colorectal tumors was evaluated through drawing a receiver operating characteristic (ROC) curve.ResultsCompared with normal controls, the expression of miR-215 in tissues of colorectal cancer and colorectal adenoma was lower (F=16.603;t=5.756,3.572;P<0.01), and that in serum was also lower (F=27.329;t=7.377,4.691;P<0.01). Compared with colorectal adenoma, the expression of miR-215 in colorectal cancer was down-regulated (t=2.182,2.671;P<0.05). Low expression of miR-215 in cancer tissue and serum was associated with clinical stage of the disease (F=4.073,6.125;P<0.05), and the expression of miR-215 in cancer was positively correlated with that in serum (r=0.696,P<0.01), but the expression of miR-215 was not correlated with clinical features of colorectal adenoma (P>0.05). ROC curve analysis demonstrated that the area under the ROC curve of serum miR-215 in the cancer and normal control group was 0.855 (95%CI=0.740-0.970) and that in the adenoma and normal control was 0.774 (95%CI=0.634-0.913).ConclusionThere is a potential value of miR-215 in early diagnosis of colorectal cancer.

colorectal neoplasms; polymerase chain reaction; tissue; serum; micrornas; polymerase chain reaction

2015-04-13;

2015-09-02

婁杰(1989-)，女，碩士。

趙清喜(1966-)，男，碩士，主任醫師，碩士生導師。

R735.3

A

1008-0341(2015)06-0631-04