miRNA-411對乳癌細胞侵襲和遷移的影響

房建凱，陳枉枉，郭玲玲

(蘇州大學醫學部,江蘇 蘇州 215213 1 病理學與病理生理學教研室； 2 解剖學教研室暨細胞神經生物學研究室)

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miRNA-411對乳癌細胞侵襲和遷移的影響

房建凱1，陳枉枉2，郭玲玲1

(蘇州大學醫學部,江蘇 蘇州 215213 1 病理學與病理生理學教研室； 2 解剖學教研室暨細胞神經生物學研究室)

目的 探討微小RNA-411(miRNA-411)對人乳癌細胞株MDA-MB-231增殖、侵襲和遷移的影響。方法 采用實時定量PCR方法檢測高轉移性乳癌細胞MDA-MB-231與低轉移性乳癌細胞MCF-7中miRNA-411的表達。采用LipofectamineTM2000將miRNA-411成熟子(Mimic)轉染至MDA-MB-231細胞中，通過采用實時定量PCR方法檢測miRNA-411 Mimic的轉染效率，Transwell法檢測細胞的遷移和侵襲能力,免疫蛋白印跡法檢測E-鈣黏素(E-cadherin)和波形蛋白(Vimentin)的表達，MTT實驗檢測MDA-MB-231細胞的增殖能力。結果miRNA-411在MDA-MB-231細胞中的表達水平顯著低于MCF-7細胞(t=7.45,P<0.01)。miRNA-411 Mimic瞬時轉染MDA-MB-231細胞后，其遷移和侵襲能力均受到明顯的抑制(t=7.24、6.62,P<0.01)，而且經轉染的細胞E-cadherin表達升高，而Vimentin表達下降。然而，miRNA-411 Mimic對MDA-MB-231細胞增殖能力無明顯影響(P>0.05)。結論 miRNA-411在高轉移性乳癌細胞中低表達，轉染miRNA-411 Mimic后乳癌細胞MDA-MB-231遷移和侵襲能力明顯減弱，其遷移和侵襲能力的下降并非通過降低MDA-MB-231細胞的增殖能力所致，而是可能通過逆轉MDA-MB-231細胞的上皮-間質轉化過程實現的。

乳房腫瘤；MDA-MB-231；miRNA-411；細胞運動；腫瘤侵潤

乳癌是一種常見的惡性腫瘤，目前已位于女性惡性腫瘤首位，其發病率呈逐年上升的趨勢，而腫瘤發生轉移是導致乳癌病人死亡的首要原因[1]。業已證實，微小RNA(miRNA)是一類內源性非編碼短鏈RNA，在轉錄后水平通過與靶基因mRNA的3′端非編碼區(3-UTR)互補，破壞目標特異性基因的轉錄產物，調控腫瘤細胞增殖、凋亡、侵襲和轉移等相關基因的表達，進而影響腫瘤的發生發展和惡性轉變[2-3]。上皮-間質轉化(EMT)是腫瘤細胞發生轉移的第一步，其機制是細胞間黏附能力的逐漸喪失和細胞遷移能力的逐漸增強。研究結果表明，在EMT 過程中腫瘤細胞表型會發生變化，上皮細胞特性消失，而出現間質細胞的特性，同時其遷移和運動能力增強[4]。有文獻研究結果表明，相比正常腺體組織，miRNA-411在乳癌組織中表達水平下降[5]。有關miRNA-411對乳癌細胞生物學行為影響的研究尚少。本課題旨在研究miRNA-411在低轉移性乳癌細胞和高轉移性乳癌細胞中表達水平的差異，并通過進一步的體外實驗探討miRNA-411對乳癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響。現將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1細胞株與培養

人乳癌細胞株MCF-7和MDA-MB-231購于中國科學院細胞庫，使用含有體積分數0.10胎牛血清的DMEM培養基，置于37 ℃、含體積分數0.05的CO2培養箱中培養。

1.2主要試劑與儀器

DMEM培養基購自美國Hlyclone公司，細胞總RNA提取試劑盒購自北京天根公司，反轉錄試劑盒購買自美國Thermo公司，Real-time PCR試劑盒購自美國羅氏公司，轉染試劑LipofectamineTM2000、Opti-MEM培養基、miRNA-411成熟子(Mimic)以及Scrambled Mimic均產自美國Invitrogen公司，Transwell小室購自美國Corning公司，E-cadherin抗體和Vimentin抗體均購自Abcam公司。

1.3Real-time PCR 方法檢測miRNA-411表達

分別提取MDA-MB-231和MCF-7兩種乳癌細胞的總RNA并將其反轉錄為cDNA。利用cDNA對miRNA-411表達量進行Real-time PCR檢測，其中miRNA-411的上游引物序列為5′-GGGGGGTAGTAGACGACCGTATAG-3′，下游引物序列為5′-CAGTGCGTGTCGTGGA-3′(康成公司合成)。以cDNA為模版，U6為內參照，按Fast Start Universal SYBR Green Master(Rox)說明書進行擴增，設置3個復孔。反應條件:95 ℃預變性10 min；95 ℃變性15 s、60 ℃退火與延伸60 s，共40個循環。以2-△△Ct值表示miRNA-411的相對表達量。

1.4miRNA-411 Mimic轉染MDA-MB-231細胞

將miRNA-411 Mimic(序列為UAGUAGACCGUAUAGCGUACG)、Scrambled Mimic(序列為CAGUACUUUUGUGUAGUACAA，該序列為無義序列)粉末離心后，采用ddH2O將其溶解配制成濃度為20 μmol/L的溶液。轉染前1 d鋪6孔板，待細胞融合度達到80%左右進行轉染。將稀釋后的miRNA-411 Mimic和LipofectamineTM2000混合，室溫孵育20 min。將混合液加入6孔板中，繼續培養24 h后，提取總RNA進行Real-time PCR反應，測量miRNA-411 Mimic轉染實驗組和Scrambled Mimic轉染實驗組的miRNA-411的表達水平。

1.5細胞遷移實驗檢測miRNA-411 Mimic對于MDA-MB-231細胞遷移能力的影響

將實驗組分成miRNA-411 Mimic轉染實驗組、Scrambled Mimic轉染實驗組和未轉染實驗組(Mock組)，將MDA-MB-231細胞消化離心，用無血清培養基調整細胞密度至108/L。取200 μL該細胞懸液加入小室中，在下室加入500 μL完全培養基，繼續培養24 h后，取出小室，以40 g/L的多聚甲醛溶液固定，結晶紫染色后，取100 μm邊長等面積計算細胞數量。

1.6細胞侵襲實驗檢測miRNA-411 Mimic對于MDA-MB-231 細胞侵襲能力的影響

實驗前1 d將基質膠與無血清培養基按1∶5比例鋪于小室中，置于37 ℃的培養箱中孵育過夜。然后，將實驗組分成miRNA-411 Mimic轉染實驗組、Scrambled Mimic轉染實驗組和未轉染實驗組，將MDA-MB-231細胞消化離心，用無血清培養基調整細胞密度至108/L。取200 μL該細胞懸液加入小室中，在下室加入500 μL完全培養基，培養24 h后，取出小室，以40 g/L的多聚甲醛溶液固定，結晶紫染色后，在顯微鏡下計數不同視野下細胞數目。

1.7Western blotting檢測miRNA-411 Mimic對MDA-MB-231 EMT過程的影響

將實驗組分成miRNA-411 Mimic轉染實驗組、Scrambled Mimic轉染實驗組和未轉染實驗組，在6孔板中轉染細胞48 h后，裂解細胞，提取蛋白質，然后測定E-鈣黏素(E-cadherin)和波形蛋白(Vimentin)水平。

1.8MTT方法檢測miRNA-411 Mimic對MDA-MB-231細胞增殖的影響

將實驗組分成miRNA-411 Mimic轉染實驗組、Scrambled Mimic轉染實驗組和未轉染實驗組，每組設置5個復孔。然后于96孔板中轉染細胞，待72 h后每孔加入5 g/L MTT溶液20 μL，培養箱中孵育4 h后，每孔加入DMSO溶液150 μL，振蕩15 min，采用酶標儀測定在波長570 nm處光密度(OD)值。

1.9統計學處理

2 結 果

2.1miRNA-411在兩種細胞中的表達水平

miRNA-411在高轉移性乳癌細胞MDA-MB-231中的表達水平為0.09±0.01，而低轉移性乳癌細胞MCF-7的表達水平為1.00±0.07，兩者比較差異有顯著性(t=7.45，P<0.01)。

2.2miRNA-411 Mimic轉染MDA-MB-231細胞對miRNA-411表達量的影響

本文利用LipofectamineTM2000將miRNA-411 Mimic轉染MDA-MB-231細胞，轉染后24 h，對轉染細胞的miRNA-411表達量進行定量測定。結果表明，Scrambled Mimic轉染實驗組表達水平為1.00±0.07，miRNA-411 Mimic轉染實驗組表達水平為61.01±5.04，兩者比較差異有顯著意義(t=5.74，P<0.01)。

2.3miRNA-411 Mimic對MDA-MB-231細胞遷移和侵襲的影響

細胞遷移實驗結果顯示，miRNA-411 Mimic轉染實驗組細胞遷出數量為23.73±2.21，Scrambled Mimic轉染實驗組為71.02±4.51，兩者比較差異有顯著性(t=7.24，P<0.01)。但Scrambled Mimic轉染實驗組細胞遷出數量為71.02±4.51，未轉染實驗組為76.05±5.43，兩組相比較差異無顯著意義(P>0.05)。細胞侵襲實驗結果顯示，miRNA-411 Mimic轉染實驗組細胞降解基質膠并且遷出的數量為23.92±3.52，Scrambled Mimic轉染實驗組為67.68±5.28，兩者比較差異有顯著意義(t=6.62，P<0.01)；而Scrambled Mimic轉染實驗組與未轉染實驗組(72.35±6.53)比較，差異無顯著性(P>0.05)。見圖1。

2.4miRNA-411 Mimic 對于MDA-MB-231 細胞EMT 過程的影響

細胞轉染48 h后，miRNA-411 Mimic轉染組細胞E-cadherin蛋白表達相比Scrambled Mimic 轉染組有所提高，而未轉染組與Scrambled Mimic 轉染組間并無明顯差異。而miRNA-411 Mimic轉染組細胞Vimentin蛋白表達相比Scrambled Mimic轉染組有所下降，而未轉染組與Scrambled Mimic轉染組間并無明顯差異。見圖2。

圖1 miRNA-411 Mimic抑制MDA-MB-231細胞的遷移和侵襲能力(結晶紫染色，100倍)

圖2 miRNA-411 Mimic轉染對E-cadherin和Vimentin蛋白表達的影響

2.5miRNA-411 Mimic對MDA-MB-231細胞增殖的影響

細胞轉染72 h后， miRNA-411 Mimic轉染組細胞的增殖能力為0.43±0.05，Scrambled Mimic轉染組為0.49±0.03，未轉染組為0.45±0.01，前者及后者與Scrambled Mimic 轉染組比較差異無顯著意義(P>0.05)。

3 討 論

乳癌發病率位于女性惡性腫瘤首位，其轉移是導致乳癌病人死亡的首要原因[6]。因此，抑制乳癌轉移成為乳癌治療的關鍵。目前的研究結果顯示，miRNA參與乳癌發生發展，并最終導致乳癌浸潤和轉移。Vimentin蛋白是間質細胞表面標記物，其在上皮性腫瘤細胞中高表達是EMT發生的重要標志；E-cadherin蛋白是上皮細胞表面標記物，其表達的丟失是EMT發生的另一重要標志[4]；逆轉腫瘤細胞EMT的發生，使其重新表達E-cadherin蛋白，是抑制腫瘤細胞的侵襲和轉移的重要措施[7]。

miRNAs在EMT中充當增強劑或抑制劑。例如，Twist能誘導miRNA-10b表達，這種miRNA能夠抑制HOXD10蛋白的翻譯并造成RhoC表達升高，促進乳癌細胞EMT的發生，從而促進乳癌細胞轉移[8]。與之作用相反，miRNA-31通過協調抑制一系列促轉移基因(包括RhoA)，抑制EMT過程，從而抑制乳癌轉移[9]。

既往研究結果顯示，miRNA-411在乳癌組織中表達下調[5]。本研究結果顯示，相比低轉移性乳癌細胞，miRNA-411在高轉移性乳癌細胞中的表達水平更低，瞬時轉染miRNA-411 Mimic，乳癌細胞MDA-MB-231的遷移與侵襲能力均明顯減弱，提示miRNA-411能夠抑制乳癌細胞的侵襲和遷移能力。E-cadherin是上皮細胞的重要標志物，MDA-MB-231細胞轉染miRNA-411 Mimic后，E-cadherin蛋白的水平顯著上調，而間質細胞的標記分子Vimentin表達水平則明顯下降。但是miRNA-411 Mimic對乳癌細胞MDA-MB-231的增殖沒有影響，說明miRNA-411對乳癌細胞MDA-MB-231的遷移和侵襲的影響，不是通過抑制乳癌細胞的增殖能力，而是可能通過逆轉乳癌MDA-MB-231的EMT過程來實現。

綜上所述，miRNA-411可能通過抑制乳癌細胞EMT的發生，從而抑制乳癌細胞的侵襲和轉移。本研究為乳癌的診斷和治療提供了一個新的思路，miRNA-411可以作為預測乳癌侵襲和轉移的標志，還可成為乳癌治療新靶點，這對于提高乳癌病人的生存率會起到極大的幫助。

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(本文編輯 厲建強)

EFFECT OF MIRNA-411 ON INVASION AND MIGRATION OF HUMAN BREAST CANCER CELLS

FANGJiankai,CHENWangwang,GUOLingling

(Department of Pathology and Pathophysiology, Medical College of Soochow University, Suzhou 215213, China)

ObjectiveTo investigate the impact of microRNA-411 (miRNA-411) on proliferation, migration and invasion of human breast cancer cell line MDA-MB-231.MethodsThe expression of miRNA-411 was detected in highly metastatic breast cancer MDA-MB-231 cells and lowly metastatic breast cancer MCF-7 cells by real-time PCR assay. Employing LipofectamineTM2000, miRNA-411 mimic was transfected into breast cancer MDA-MB-231 cells. The transfection efficiency of miRNA-411 mimic was detected by real-time PCR assay, and the migration and ability of the cells measured by Transwell assay, the expressions of E-cadherin and vimentin by Western blotting, and the proliferation of the cells by MTT assay.ResultsThe expression of miRNA-411 in MDA-MB-231 cells was significantly lower than MCF-7 cells (t=7.45,P<0.01). After miRNA-411 mimic was transiently transfected into MDA-MB-231 cells, the migration and invasion of MDA-MB-231 cells were significantly inhibited (t=7.24,6.62;P<0.01). The expression of E-cadherin in infected cells elevated, and that of Vimentin declined. No significant impact of miRNA-411 mimic on the reproductive activity of MDA-MB-231 cells was noted (P>0.05).ConclusionmiRNA-411 is lowly expressed in highly metastatic breast cancer cells. The migration and invasion of breast cancer MDA-MB-231 cells are significantly inhibited after transfection with miRNA-411 mimic, the suppression of the migration and invasion is not due to reducing the proli-feration ability of MDA-MB-231 cells, but possibly through inversion of epithelial-mesenchymal transition of MDA-MB-231 cells.

breast neoplasms; MDA-MB-231; miRNA-411; cell movement; neoplasm invasiveness

2015-05-15;

2015-08-17

房建凱(1990-)，男，碩士研究生。

郭玲玲(1963-)，女，碩士，副教授。

R737.9

A

1008-0341(2015)06-0637-04