山茱萸對大鼠糖尿病腎病的作用

李晨

(山東大學齊魯醫院(青島)內分泌科，山東 青島 266000)

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山茱萸對大鼠糖尿病腎病的作用

李晨

(山東大學齊魯醫院(青島)內分泌科，山東 青島 266000)

目的 探討山茱萸對糖尿病大鼠糖尿病腎病的影響及機制。方法 采用腹腔注射鏈脲佐菌素方法構建糖尿病模型，將Sprague-Dawley大鼠隨機分為正常對照組、糖尿病組、山茱萸小劑量(400 mg·kg-1·d-1)干預組及山茱萸大劑量(800 mg·kg-1·d-1)干預組和氟伐他汀陽性對照組，每組10只。造模20周后檢測各組大鼠腎臟體質量比(K/B)，血漿肌酐、尿素氮和尿酸的含量，腎小管間質谷胱甘肽(GSH)、活性氧(ROS)含量，腎組織骨形態發生蛋白-7(BMP-7)、Smad3、Smad5、Smad7、轉化生長因子-β(TGF-β)、單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)、核轉錄因子(NF-κB) mRNA表達。結果 與正常對照組比較，糖尿病組大鼠腎臟K/B增高，血漿肌酐、尿素氮和尿酸的含量增高，腎組織BMP-7、Smad3、Smad5、Smad7、TGF-β、ROS、MCP-1和NF-κB表達上調，GSH表達下調，差異均有顯著性(F=8.16～127.30，P<0.05)。與糖尿病組比較，小劑量和大劑量山茱萸干預組大鼠腎臟K/B、血漿肌酐、尿素氮和尿酸含量下降，BMP-7、Smad3、Smad5、Smad7、TGF-β、ROS、MCP-1和NF-κB表達下降，GSH表達增加，差異均有顯著性(q=2.842～243.400，P<0.05)。結論 山茱萸可抑制糖尿病大鼠腎小管間質損傷，降低氧化應激可能是其作用機制。

山茱萸；糖尿病腎病；氧化性應激

糖尿病是一種以血糖升高為特征的代謝性疾病，長期血糖升高可累及其他臟器的微管系統，包括眼、腎臟和神經[1]。糖尿病腎病是糖尿病病人的常見并發癥，主要癥狀包括持續性大量清蛋白尿、腎病綜合征、腎小球濾過率(GFR)下降，并最終導致腎衰竭。降低血糖，控制和治療并發癥是治療糖尿病的主要目標[2-3]。臨床研究結果顯示，山茱萸可顯著降低糖尿病病人血糖水平，同時在改善病人臨床癥狀，減緩腎衰竭和降低尿蛋白方面具有顯著效果[4-5]。NADPH氧化酶是糖尿病腎病發生的危險因素之一，其導致的氧化應激可影響腎臟細胞、細胞外基質及腎臟血管通透性，與糖尿病腎病密切相關[6]。本文觀察山茱萸通過下調糖尿病大鼠體內氧化應激水平，對糖尿病大鼠腎臟纖維化水平的作用。

1 材料與方法

1.1實驗材料

雄性Sprague-Dawley大鼠，體質量為(200±10)g，購自上海斯萊克實驗動物有限公司；鏈脲佐菌素、雙氫羅丹明-123，均購自美國Sigma公司；氟伐他汀購自諾華制藥有限公司；谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)和超氧化物歧化酶(SOD)活力檢測試劑盒、谷胱甘肽(GSH)含量檢測試劑盒，均購自碧云天生物技術有限公司；核蛋白提取試劑盒購自美國Pierce公司；血漿肌酐、尿素氮和尿酸檢測試劑盒均購自美國Siemens公司；RNA逆轉錄試劑盒購自日本KaTaRa公司。

1.2糖尿病動物模型構建

雄性Sprague-Dawley大鼠50只，隨機分為正常對照組(N組)、糖尿病組(D組)、山茱萸低劑量組(FC-L組)、山茱萸高劑量組(FC-H組)及氟伐他汀組(Flu組)，每組10只。大鼠腹腔按55 mg/kg劑量注射鏈脲佐菌素構建糖尿病大鼠模型，FC-L組大鼠按400 mg/(kg·d)灌胃給山茱萸，FC-H組大鼠按800 mg/(kg·d)灌胃給山茱萸，Flu組作為陽性對照組按20 mg/(kg·d)灌胃給Flu組，N組和D組給予等體積生理鹽水，共喂養12周。

1.3檢測指標及方法

1.3.1大鼠腎臟體質量比(K/B) 大鼠處死后，稱量大鼠體質量(BW)，剪取左腎，稱取其質量(KW)，計算K/B。K/B=KW×2/BW。

1.3.2肌酐、尿素氮和尿酸含量 斷頭處死大鼠，用抗凝管收集血液，顛倒混勻，4 ℃ 下以3 000 r/min離心10 min，取血漿，按照試劑盒說明書測定肌酐、尿素氮和尿酸含量。

1.3.3腎臟組織中活性氧(ROS)和GSH的表達①將大鼠腎臟組織剪碎，篩網過濾，收集游離細胞，加入1 μmol/L雙氫羅丹明-123，在37 ℃、體積分數0.05的CO2條件下孵育2 h，通過流式細胞儀檢測488 nm激發波長下ROS表達。②腎臟細胞經液氮和37 ℃水浴快速凍融2次，離心，取上清按照試劑盒說明書測定GSH含量。

1.3.4大鼠腎臟組織中NF-κB、BMP-7、Smad3、Smad5、Smad7、TGF-β和MCP-1的mRNA水平將大鼠腎臟組織經TRIZOL法提取總RNA，按以下序列進行擴增。NF-κB上游引物：5′-GAAGAAG-CGAGACCTGGAG-3′，下游引物：5′-TCCGGAAC-ACAATGGCCAC-3′；BMP-7上游引物：5′-TCCGA-TTCCCTGCCCAAGTG-3′，下游引物：5′-AGGCCG-TCTTCAGTACCCAGG-3′；Smad3上游引物：5′-G-CAGAACGTCAACACCAAGTGC-3′，下游引物：5′-GTGCAGGTCTGGCCATCGC-3′；Smad5上游引物：5′-AATGAATTGTATCCTGCCGGTA-3′，下游引物：5′-TAAACAATCGTGTTGGGGAAGC-3′；Smad7上游引物：5′-CCATCACCTTAGCCGACTCT-3′，下游引物：5′-GCAAAAGCCATTCCCCTGAG-3′；TGF-β上游引物：5′-CCCAGCATCTGCAAAGCTC-3′，下游引物：5′-GTCAATGTACAGCTGCCGCA-3′；MCP-1上游引物：5′-TTGACCCGTAAATCTGAA-GCTAAT-3′，下游引物：5′-TCACAGTCCGAGTC-ACACTAGTTCAC-3′；GAPDH上游引物：5′-ACCACAGTCCATGCCATCTA-3′，下游引物：5′-TCCACCACCCTGTTGCTGAC-3′。檢測各組大鼠腎臟組織中NF-κB、BMP-7、Smad3、Smad5、Smad7、TGF-β和MCP-1的mRNA水平。

1.4統計學處理

應用SPSS 10.0軟件進行統計學處理，數據間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)。

2 結 果

2.1各組大鼠K/B比較

D組大鼠的K/B與N組比較明顯增高，FC-H組、Flu大鼠的K/B均較D組顯著下降，差異有顯著性(F=8.16，P<0.05)。見表1。

2.2各組大鼠血漿中肌酐、尿素氮和尿酸含量比較

D組大鼠的肌酐、尿素氮和尿酸含量與N組比較明顯增高，差異有顯著意義(F=80.36～109.70,P<0.05)；山茱萸及Flu干預后，大鼠的肌酐、尿素氮和尿酸含量均顯著下降,與FC-L組比較，FC-H組的下降更顯著,差異均有統計學意義(q=2.842～27.210,P<0.05)。見表1。

2.3各組大鼠腎臟組織中ROS、GSH表達比較

D組大鼠的ROS表達與N組比較明顯增高，GSH表達降低，差異有顯著意義(F=95.78、22.88,P<0.05)；山茱萸及Flu干預后，ROS表達顯著下降,GSH表達升高，與FC-L組比較，FC-H組變化更顯著(q=2.148～23.420,P<0.05)。見表2。

2.4各組大鼠腎臟組織中BMP-7、Smad3、Smad5、Smad7、TGF-β、MCP-1和NF-κB mRNA表達比較

D組大鼠的BMP-7、Smad3、Smad5、Smad7、TGF-β、MCP-1和NF-κB mRNA表達與N組比較均明顯增高，差異有顯著意義(F=42.45～127.30，P<0.05);山茱萸及Flu干預后，大鼠以上各指標均顯著下降，與FC-L組比較，FC-H組下降更顯著(q=3.748～243.400,P<0.05)。見表3。

3 討 論

糖尿病是一種以血糖升高為特征的慢性代謝性疾病，糖尿病腎病是常見并發癥之一，可導致病人腎衰竭。研究表明，高糖血癥和高脂血癥可引起氧化應激，ROS及其引發的氧化應激反應可以觸發Smad/TGF-β和NF-κB/AKT信號通路，上調BMP-7和MCP-1，從而引起腎臟的炎癥損傷和纖維化，導致血管和微管系統細胞損傷，進而引起腎臟功能的不可逆損傷[7-12]。

表1 各組大鼠K/B及血漿肌酐、尿素氮和尿酸相對含量

表2 各組大鼠腎臟組織ROS及GSH表達

表3 各組BMP-7、Smad3、Smad5、Smad7、TGF-β、MCP-1和NF-κB mRNA表達

山茱萸味酸、澀，微溫，歸肝、腎經，能補益肝腎，滋陰補氣。大部分糖尿病病人屬于氣陰兩虛型病癥，所以山茱萸可用于治療糖尿病。臨床研究顯示，山茱萸可有效改善胰島素抵抗，降低血糖，改善糖尿病腎病的癥狀，是一種可有效治療糖尿病的天然產物[13-14]。血肌酐、尿素氮和尿酸分別為含氮的有機物、蛋白質代謝和嘌呤代謝的終末產物。在腎功能正常的情況下，其可從腎小球濾出，當糖尿病損傷腎臟使腎小球濾過率下降時，血肌酐、尿素氮和尿酸迅速升高，表示腎功能已嚴重損害。Flu作為廣泛使用的降脂藥物，在多個研究中被作為陽性對照，因此本文將Flu組作為陽性對照觀察山茱萸對大鼠糖尿病腎病的治療作用。

本文研究結果顯示，糖尿病模型組大鼠的K/B、血肌酐、尿素氮和尿酸含量以及ROS表達與N組比較明顯增高，GSH表達降低，差異有顯著性；與D組比較，山茱萸及Flu干預后，大鼠的K/B、血肌酐、尿素氮和尿酸含量以及ROS表達均顯著下降，而GSH表達增高；且與FC-L組比較，FC-H組的變化更顯著，差異有顯著性。提示山茱萸可能通過降低氧化應激反應發揮生物學作用。

本文結果還顯示，糖尿病模型組大鼠的BMP-7、Smad3、Smad5、Smad7、TGF-β mRNA與N組比較明顯增高。與D組比較，山茱萸及Flu干預后，以上各指標均顯著下降；且與FC-L組比較，FC-H組的下降更顯著，提示山茱萸可通過調節BMP-7、Smad3、Smad5、Smad7、TGF-β、MCP-1和NF-κB表達，逆轉腎臟的炎癥和纖維化。因此，推測山茱萸抑制腎臟損傷與間質纖維化的機制是抑制BMP-7、Smad3、Smad5、Smad7、TGF-β信號通路及其下游蛋白的表達。

綜上所述，山茱萸可有效治療大鼠糖尿病腎病，為臨床應用提供實驗基礎。

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(本文編輯 黃建鄉)

EFFECT OF FRUCTUS CORNI ON DIABETIC NEPHROPATHY IN RATS

LIChen

(Department of Endocrinology, Qilu Hospital of Shandong University, Qingdao 266000, China)

ObjectiveTo investigate the effect of Fructus Corni on diabetic nephropathy in rats and its mechanism.MethodsA diabetic model of rats was created using intraperitoneal injection of Streptozotocin, and 40Sprague-Dawleyrats were randomized to four equal groups: normal control group, diabetes group, low-dose Fructus Corni group (400 mg·kg-1·d-1), and high-dose Fructus Corni group (800 mg·kg-1·d-1). Twenty weeks after modelling, the following items were detected in rats of each group: kidney to body weight ratio (K/B), plasma creatinine, urea nitrogen and uric acid; the levels of glutathione (GSH) and reactive oxygen species (ROS) in rat kidney cells; the expressions of bone morphogenetic protein-7 (BMP-7), Smad3, Smad5, Smad7, transforming growth factor-β (TGF-β), Monocyte Chemotactic Protein-1 (MCP-1) and nuclear transcription factor-κB (NF-κB).ResultsCompared with the normal group, rats in the diabetes group showed significant increase in K/B, plasma levels of ROS, creatinine, urea nitrogen and uric acid, up-regulation of expressions of BMP-7, Smad3, Smad5, Smad7, TGF-β, ROS, MCP-1 and NF-κB in renal tissue, and down expression of GSH (F=8.16-127.30,P<0.05). Compared with the diabetes group, rats in the low-dose and high-dose Fructus Corni groups, K/B, plasma levels of creatinine, urea nitrogen and uric acid, and the expressions of BMP-7, Smad3, Smad5, Smad7, TGF-β, ROS, MCP-1 and NF-κB declined, and the expression of GSH up-regulated (q=2.842-243.400,P<0.05).ConclusionFructus Corni can relieve damage of renal tubular interstitial in diabetic rats, reducing oxidative stress may be its mechanism of action.

fructus corni; diabetic nephropathies; oxidative stress

2015-03-27;

2015-07-26

李晨(1978-)，女，碩士，主治醫師。

R587.24

A

1008-0341(2015)06-0674-04