二甲基鞘氨醇抑制人RA-FLS增殖及IL-6和IL-8的分泌

袁紅霞，邱振宇，周 盾

(遼寧醫學院1.護理學院;2.附屬第一醫院 感染科;3.附屬第一醫院 高壓氧科，遼寧 錦州121001)

類風濕關節炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種慢性炎性反應疾病，迄今病因及機制仍不清楚。成纖維樣滑膜細胞(fibroblast-like synoviocytes，FLS)具有類腫瘤細胞特性，在RA 發病中備受關注。二甲基鞘氨醇(N，N-dimethyl-D-erythro-sphingosine，DMS))是鞘氨醇激酶1(sphingosine kinase 1，SPHK1)的特異性抑制劑，能有效抑制SPHK1 活性，參與RA的發病[1]。本研究觀察DMS 對人RA-FLS增殖及分泌IL-6和IL-8的影響及其可能的機制。

1 材料與方法

1.1 材料:DMEM 高糖培養基、胎牛血清和胰蛋白酶(Hyclone 公司);WST-1 細胞增殖檢測試劑盒和結晶紫(碧云天生物技術研究所);抗SPHK1 多克隆抗體(Abgent 公司);白介素-6和白介素-8 ELISA 試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 人RA-FLS 培養及活性檢測:人RA-FLS(Cell Applications 公司)用含10% 胎牛血清的DMEM 高糖培養液于37℃、5% CO2條件培養，接種于96 孔(約2 000個/孔)，對照組不加DMS，實驗組分別加5、10、15 和20 μmol/L DMS，24、48 和72 h后按WST-1 試劑盒說明書檢測各組細胞的增殖活性。

1.2.2 結晶紫染色:各組細胞培養48 h后，用4%多聚甲醛固定15 min，結晶紫染色10 min，倒置顯微鏡觀察細胞形態并拍照。

1.2.3 Western blot檢測SPHK1蛋白的表達:按說明書檢測對照組及DMS(10 μmol/L)組SPHK1蛋白。

1.2.4 ELISA 檢測IL-6和IL-8的分泌:按說明書檢測DMS(10 μmol/L)組RA-FLS 上清液中不同時間點(24、48 和72 h)IL-6和IL-8的分泌水平。

1.3 統計學分析:采用Graphpad Prism 5.0 進行作圖和分析。實驗數據以均數±標準差(±s)表示，兩組之間計量資料的比較采用t 檢驗，多組之間計量資料的比較采用Oneway ANVOVA法。

2 結果

2.1 DMS 呈時間劑量依賴性抑制人RA-FLS的增殖(表1)。

表1 DMS 抑制人RA-FLS增殖Table1 DMS inhibits RA-FLS proliferation(±s，A value，n=6)

表1 DMS 抑制人RA-FLS增殖Table1 DMS inhibits RA-FLS proliferation(±s，A value，n=6)

＊P＜0.05 compared with control group.

group time/hours 24 48 72 control 1.65±0.28 1.72±0.12 1.67±0.05 DMS 5 μmol/L 1.50±0.16 1.45±0.09* 1.31±0.04*DMS 10 μmol/L 1.17±0.18* 1.02±0.18* 0.39±0.01*DMS 15 μmol/L 1.01±0.15* 0.63±0.08* 0.40±0.01*DMS 20 μmol/L 0.71±0.18* 0.47±0.05* 0.37±0.01*

2.2 DMS 影響人RA-FLS的形態:5、10、15 和20 μmol/L DMS 作用48 h后，細胞由長梭形變成不規則形，細胞密度明顯降低，個別核出現固縮，胞質中有空泡(圖1)。

2.3 DMS(10 μmol/L)抑制SPHK1蛋白表達:48 h后，DMS組SPHK1蛋白水平為0.41±0.19，明顯低于對照組的1.01±0.19(n=3)(P＜0.05)(圖2)。

2.4 DMS(10 μmol/L)抑制IL-6和IL-8 分泌:與24 h 相比，72 h IL-6和IL-8 分泌減少，(P＜0.05);與48 h 比較，72 h時IL-8 分泌減少(P＜0.05)(表2)。

圖1 DMS 對人RA-FLS 形態的影響Fig1 Morphological alteration of RA-FLS following treatment with DMS(×200)

圖2 DMS 抑制SPHK1蛋白表達Fig2 DMS inhibits SPHK1 expression

表2 DMS 抑制IL-6和IL-8 分泌Table2 DMS inhibits the secretion of IL-6/8(±s，pg/mL，n=3)

表2 DMS 抑制IL-6和IL-8 分泌Table2 DMS inhibits the secretion of IL-6/8(±s，pg/mL，n=3)

*P＜0.05 compared with 24 hours;#P＜0.05 compared with 48 hours.

time/hours IL-6 IL-8 24 68.65±4.91 92.07±2.44 48 53.41±4.99 83.45±4.88 72 52.24±1.67* 61.04±2.44*#

3 討論

RA-FLS 異常過度增殖，分泌促炎性因子和蛋白激酶，參與RA的炎性反應，促進骨和軟骨破壞。本研究證實DMS抑制RA-FLS增殖并明顯抑制SPHK1蛋白的表達。提示DMS 在RA 中通過抑制SPHK1的表達而具有抗細胞增殖的潛能。

RA 致病過程中炎性因子IL-6和IL-8 等分泌增加。本研究發現，DMS 減少IL-6和IL-8的分泌，表明SPHK1 可能通過調控炎性反應參與RA 發病。體外研究發現，在膠原誘導的鼠關節炎動物模型中，應用DMS 能顯著減輕關節炎性反應和骨質破壞[2]。應用SPHK1 活化后的下游代謝產物1-磷酸鞘氨醇可誘導RA-FLS 分泌IL-6和IL-8，促進基質金屬蛋白酶的產生，進而導致軟骨細胞和破骨細胞功能失調[3]，上述研究結果與本研究報道一致，說明調控SPHK1的表達，可能是延緩RA 關節進展和骨破壞的新靶點。SPHK1 調控RA-FLS增殖及IL-6和IL-8 分泌可能涉及多種信號通路，值得進一步探討。

[1]Lai WQ，Chia FLA，Leung BP.Sphingosine kinase and sphingosine-1-phosphate receptors:novel therapeutic targets of rheumatoid arthritis?[J].Future Med Chem，2012，4:727-733.

[2]Lai WQ，Irwan AW，Goh HH，et al.Anti-inflammatory effects of sphingosine kinase modulation in inflammatory arthritis[J].J Immunol，2008，181:8010-8017.

[3]Zhao C，Fernandes MJ，Turgeon M，et al.Specific and overlapping sphingosine-1-phosphate receptor functions in human synoviocytes:impact of TNF-α[J].J Lipid Res，2008.49:2323-2337.