胡蘿卜籽抗氧化肽的分離純化及活性研究

戶 佩， 胡海峰， 陳濤濤， 陳小燕， 張 楊， 洪 晶

(福州大學生物科學與工程學院， 福建 福州 350116)

胡蘿卜籽抗氧化肽的分離純化及活性研究

戶 佩， 胡海峰， 陳濤濤， 陳小燕， 張 楊， 洪 晶

(福州大學生物科學與工程學院， 福建 福州 350116)

采用凝膠過濾色譜Sephadex G-50和反相高效液相色譜對胡蘿卜籽中的抗氧化肽進行分離純化.以DPPH自由基(2， 2-二苯基-1-苦肼基)清除率為指標， 測定多肽的抗氧化活性.采用電噴霧電離質譜法測定該多肽的相對分子質量. 研究結果表明： 經過分離純化， 得到一個具有較強抗氧化活性的多肽， 在質量濃度為1 mg·mL-1時， 其DPPH自由基清除活力達到(92.02±0.47)%， 相對分子質量為339.3 u， 由3個氨基酸殘基組成.

胡蘿卜籽； 多肽； 純化； 抗氧化； 高效液相色譜

0 引言

胡蘿卜屬全球性蔬菜作物， 含有豐富的胡蘿卜素、 蛋白質、 核黃素、 糖和揮發油等， 具有增強視力、 清除氧自由基、 降壓、 抗癌和抗衰老等功效， 具有十分豐富的營養和較高的藥用價值， 菜藥雙優[1].胡蘿卜籽為傘形科胡蘿卜屬胡蘿卜(DaucuscarotaL. var. sativa DC.)的干燥成熟種子， 是一種傳統中藥， 味辛， 藥性濕熱， 含有一些具重要生物活性的成分， 有利尿通淋， 調理經水， 化排結石等功效[2]， 具有極高的研究價值和開發前景.

近些年， 人們認識到體內過多的自由基不但會加快衰老， 還可能會導致癌癥、 中風、 心肌梗塞和糖尿病等疾病[3-4]， 因此抗氧化劑的研究在國內外發展很快.抗氧化劑種類很多， 一些人工合成的抗氧化劑， 如BHT、 BHA和PG等， 對人類的酶系統有各種潛在的毒副作用[5]， 會導致肝損傷和致癌[6-7].于是人們把目光轉向從植物和動物中提取天然抗氧化劑， 其中抗氧化肽更是成為研究的熱點， 并已有多個研究者分離出天然抗氧化肽， 如Binsan等[8]從白蝦頭中提取出了抗氧化肽； Amadou等[9]采用發酵法從小米發酵粉中提取出了抗氧化肽等.

研究者從胡蘿卜籽中分離得到了一些具有抗氧化活性的成分， 如胡蘿卜籽油、 胡蘿卜素、 黃酮類等[10]， 但并未對胡蘿卜籽天然抗氧化肽進行相關探索.本研究以胡蘿卜籽為研究對象， 通過凝膠過濾色譜(Sephadex G-50)和反相高效液相色譜(reverse-phase high performance liquid chromatography， RP-HPLC)對胡蘿卜籽天然抗氧化肽進行分離純化， 得到了單一的抗氧化肽組分， 為進一步的序列鑒定和活性表征奠定基礎.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

胡蘿卜籽， 購于福州市種子市場； G-50常壓凝膠色譜柱填料， 美國GE Healthcare公司； DPPH(2, 2-二苯-1-苦肼基)， 美國sigma公司； 三氟乙酸(TFA)， 美國PE公司； 乙腈及甲醇， 色譜純； 磷酸二氫鈉、 十二水磷酸氫二鈉及其他試劑均為分析純.

1.2 儀器與設備

LC-20A高效液相色譜儀， 日本島津公司； Gemini 5 μ C18高效液相色譜柱(4.6 mm×250 mm， 10 mm×250 mm)， 美國Phenomenex公司； BS-160A自動部分收集器， 上海滬西分析儀器廠有限公司； BT01-100蠕動泵驅動器， 保定蘭格恒流泵有限公司； FD-1C-50型真空冷凍干燥機， 北京博醫康實驗儀器有限公司； XZ-21K高速冷凍離心機， 長沙湘智離心機儀器有限公司； UV/V-16/18型紫外可見分光光度計， 上海美譜達儀器有限公司； AUY120電子天平， 日本島津公司.

1.3 試驗方法1.3.1 胡蘿卜籽粗提物的制備

胡蘿卜籽經高速中藥粉碎機粉碎， 過0.250 mm篩， 按料液比為5%(體積質量分數)， 用0.02 mol·L-1pH 7.0磷酸鹽緩沖液常溫浸提12 h， 離心(4 ℃， 10 000 r·min-1， 30 min)， 取上清液， 冷凍抽干即為胡蘿卜籽粗提物， -20 ℃保存備用.

1.3.2 胡蘿卜籽抗氧化肽的分離純化

凝膠過濾色譜SephadexG-50： 將胡蘿卜籽粗提物配制成質量濃度為50 mg·mL-1的溶液， 用Sephadex G-50凝膠過濾色譜柱(1.6 cm×100 cm)分離 ， 以去離子水為洗脫液， 上樣量5 mL， 流速0.3 mL·min-1， 用自動部分收集器收集洗脫液(3 mL/管)， 用紫外檢測儀在214 nm處檢測， 收集各洗脫峰， 冷凍抽干.

高效液相色譜： 將由Sephadex G-50分離得到的具有抗氧化活性的組分配制成質量濃度為25 mg·mL-1的溶液， 加入5倍體積的乙腈沉降1 h， 離心(4 ℃， 12 000 r·min-1， 10 min)， 取上清， 待乙腈完全揮發后過0.22 μm濾膜， 用半制備型C18反相高效液相色譜柱(10 mm×250 mm)進行分離純化.以流動相A(含0.05%(體積分數， 以下均同)TFA的水)和流動相B(含0.05%TFA的乙腈)構成的洗脫系統進行梯度洗脫， 流速2.0 mL·min-1， 檢測波長λ=214 nm， 洗脫條件： 0～5 min， 5% B； 5～40 min， 5%～55% B； 40～50 min， 55% B.收集具有抗氧化活性的峰， 冷凍抽干， 并于-20 ℃保存備用.純度鑒定采用分析型C18反相高效液相色譜柱(4.6 mm×250 mm)， 流速1.0 mL·min-1， 檢測波長λ=214 nm， 洗脫梯度： 0～30 min， 5%～35% B.

1.3.3 DPPH自由基清除活力測定

以DPPH自由基清除率作為抗氧化活力的指標， 試驗方法根據Zhang等[6]稍作修改.用95%乙醇溶液溶解DPPH， 配制成濃度為0.1 mmol·L-1的溶液.取該溶液0.1 mL與等體積的樣品溶液充分混勻， 室溫下避光反應30 min， 于517 nm下測定吸光值.同時， 設對照組與樣品空白組， 每組3個平行， 用DPPH自由基的清除百分比表示樣品DPPH自由基清除活力， 按如下公式計算：

式中:A0為對照組(DPPH自由基+去離子水)吸光值；Ai為樣品組(DPPH自由基+樣品)吸光值；Aj為樣品空白組(95%乙醇+樣品)吸光值.

1.3.4 相對分子質量鑒定

電噴霧電離質譜(electrospray ionization mass spectrometry， ESI-MS)在測定肽類的相對分子質量上具有用量少、 靈敏度高、 結果準確等優點. 采用MALDI SYNAPT Q-TOF MS液相色譜串聯四級桿飛行時間質譜儀(美國Waters公司)對胡蘿卜籽抗氧化肽的相對分子質量進行測定. 質譜條件： 離子方式為ESI+； 毛細管電壓3.50 kV； 離子源溫度100 ℃； 脫溶劑氣溫度300 ℃； 檢測質核比(m/z)范圍為50～3 000.

2 結果與討論

2.1 凝膠過濾色譜純化

將胡蘿卜籽粗提物凍干粉用去離子水溶解， 采用Sephadex G-50凝膠過濾色譜分離， 測定洗脫液在214 nm波長下吸光值， 繪制洗脫曲線(見圖1).胡蘿卜籽粗提物經凝膠過濾色譜獲得初步分離， 根據相對分子質量大小不同被分離成4個組分， 按相對分子質量從大到小順序分別命名為： F1、 F2、 F3和F4.收集各組分， 進行抗氧化活性的測定.

將F1～F4組分均配制成質量濃度為1 mg·mL-1的溶液， 以DPPH自由基清除率為指標測定抗氧化活力.如圖2所示， 相對分子質量大小不同的4個組分(F1、 F2、 F3和F4)顯示出不同的DPPH自由基清除活力.相對分子質量較大的F1和F2組分， 其DPPH自由基清除率較低， 在質量濃度為1 mg·mL-1時， 對DPPH自由基的清除率僅達到(6.05±0.33)%和(0.80±0.33)%， 而相對分子質量較小的組分F3和F4具有較高活力， 在質量濃度為1 mg·mL-1時， DPPH自由基清除率分別為(31.39±3.07)%和(29.57±0.64)%.有研究表明， 相對分子質量較小的多肽其抗氧化活力較強， 如謝正軍[11]報道的苜蓿蛋白凝膠色譜分離組分D和李艷紅[12]報道的鷹嘴豆蛋白凝膠色譜分離組分FRA. IV相對分子質量均較小， 抗氧化能力較強.反復收集抗氧化活性較高的組分F3和F4， 冷凍抽干， 進行反相高效液相色譜分離.

圖1 胡蘿卜籽粗提物的凝膠過濾色譜圖

圖2 凝膠過濾色譜各洗脫峰的DPPH自由基清除率

2.2 反相高效液相色譜純化

將組分F3和F4凍干粉用去離子水溶解后加入5倍體積的乙腈沉降.組分F3經沉降后出現沉淀， 離心取上清， 進行RP-HPLC分離， 發現其在214 nm處的紫外吸收強度很弱， 可能是由于組分F3經乙腈沉降后上清中含有的多肽含量較少.對組分F4進行RP-HPLC分離， 得到了14個主要洗脫組分(見圖3)， 反復收集各組分， 冷凍抽干.

圖3 F4組分的反相高效液相色譜圖

將RP-HPLC分離得到的14個組分均配制成質量濃度為1 mg·mL-1的溶液， 測定各組分抗氧化活性.如圖4所示， 組分P10和P13的DPPH自由基清除活力最強， 分別達到(92.02±0.47)%和(92.01±0.13)%.從洗脫曲線可以看出， 組分P10和P13的保留時間都較長， 疏水性較強， 對DPPH自由基的清除活力也較高.相關研究表明， 多肽富含疏水性氨基酸比富含親水性氨基酸對抗氧化活性的貢獻更大[5]， 但多肽的抗氧化活性除與其疏水性相關外， 還與其序列有關， 如Suetsuna等[13]從酪蛋白水解物中分離出的抗氧化肽， 氨基酸序列為Tyr-Phe-Tyr-Pro-Glu-Leu， 研究表明其C端的Glu-Leu對它的抗氧化能力有增強作用.收集組分P10和P13， 冷凍抽干， 進行純度鑒定.

采用分析型C18反相高效液相色譜柱鑒定組分P10和P13的純度， 結果發現組分P13純度不高， 而組分P10純度較高.如圖5所示， 組分P10經分析型C18反相柱分離后， 得到單一峰， 反復收集組分P10， 冷凍干燥后進行相對分子質量鑒定.

圖4 RP-HPLC各洗脫峰的DPPH自由基清除率

圖5 RP-HPLC分離組分P10的純度鑒定

2.3 相對分子質量鑒定

圖6 RP-HPLC分離組分P10的質譜圖

利用液質聯用儀對組分P10的相對分子質量進行測定， 質譜結果如圖6所示.從圖6可知， 質核比為340.3的峰是組分P10的分子離子峰[M+H]+， 因此組分P10的實際相對分子質量為339.3 u， 經推測是三肽， 可能的氨基酸組成為Cys-Ser-Met、 Ala-Lys-His、 Ala-Ser-Tyr、 Ala-Phe-Cys.有研究表明， 含2～10個氨基酸的小肽的抗氧化能力更強.如Je等[14]發現了相對分子質量小于1 000 u的阿拉斯加鱈魚骨多肽的抗氧化活性比其他相對分子質量的肽段強.Roberts等[15]也發現， 相對分子質量較小的肽能更好地進入細胞膜發揮抗氧化作用.從胡蘿卜籽中分離得到的抗氧化三肽P10相對分子質量較小， 因而可能具有較強的抗氧化活性.

多肽的抗氧化活性除與相對分子質量大小有關外， 還與其氨基酸組成和序列等因素有關. 某些多肽中氨基酸殘基的特殊支鏈結構被認為是自由基的直接清除者， 如含吲哚基的色氨酸， 含咪唑環的組氨酸， 含酚羥基的酪氨酸， 以及含硫的半胱氨酸和甲硫氨酸等.組氨酸的α-氨基和咪唑基與金屬離子可形成六元環， 羧基和咪唑基與金屬離子可形成七元環[16]. Chen[17]等都分離到含組氨酸抗氧化肽， 并指出其抗氧化活性與螯合金屬離子有關. 酪氨酸具有供氫能力， 能夠將氫原子給予自由基， 自身形成自由基中間體苯氧自由基， 借助共振求得穩定， 使得自由基鏈反應減慢或終止[16]. 含硫氨基酸對動物生理功能具有重要的調節作用， 這主要是因為其維持了機體氧化還原狀態的平衡．如Met殘基， 它能被氧化生成甲硫氨酸亞砜(Met0)， 從而保護其它必需氨基酸免受氧化傷害， 以發揮抗氧化作用[18].自胡蘿卜籽中分離出的三肽P10， 其抗氧化機制可能與組氨酸、 酪氨酸、 半胱氨酸和甲硫氨酸有關.

3 結語

隨著分離技術的進步， 經分離純化得到的活性肽也不斷增加.從植物來源的抗氧化肽已經得到了深入的研究， 不但可以作為營養成分， 同時在藥物研發方面也具有重要的作用， 其中一些已經商業化.以胡蘿卜籽為研究對象， 經凝膠過濾色譜Sephadex G-50和反相高效液相色譜純化從胡蘿卜籽粗提物中得到了抗氧化小肽P10， 經LC-ESI-MS鑒定相對分子質量為339.3 u， 推測其含有3個氨基酸.抗氧化研究結果表明， 純化后的組分P10具有很強的抗氧化活性， 在質量濃度為1 mg·mL-1時， 對DPPH自由基的清除活力高達(92.02±0.47)%.從胡蘿卜籽中分離出的天然抗氧化肽， 為其后續的序列鑒定和活性表征奠定了基礎.同時， 也為胡蘿卜籽抗氧化肽的開發和利用提供了理論依據.

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(責任編輯： 洪江星)

Purification and characterization of carrot seed-derived sntioxidant peptide

HU Pei, HU Haifeng, CHEN Taotao, CHEN Xiaoyan, ZHANG Yang, HONG Jing

(College of Biological Science and Engineering, Fuzhou University, Fuzhou, Fujian 350116， China)

In the present study, the antioxidant peptides from carrot seeds were purified by size exclusion chromatography Sephadex G-50 and RP-HPLC (reverse-phase high performance liquid chromatography). The antioxidant activity of each fraction was evaluated by DPPH (2, 2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) radical-scavenging effect. The molecular mass of the antioxidant peptide was identified by electrospray ionization mass spectrometry (ESI-MS). Finally, an antioxidant peptide with a molecular mass of 339.3 u was obtained. It exhibited strong DPPH radical-scavenging capability, and the scavenging rates reached to (92.02±0.47)% at the concentration of 1 mg·mL-1. The results indicated that carrot seed-derived peptides showed strong antioxidant activity.

carrot seeds; peptide; purification; antioxidant; HPLC

2014-05-20

洪晶(1981-)， 副教授， 主要從事食品生物技術方面研究, jhong@fzu.edu.cn

福建省科技廳科研資助項目(2013J05050)

10.7631/issn.1000-2243.2015.06.0846

1000-2243(2015)06-0846-05

Q514.3

A