實驗應激致小鼠福利受損及音樂干預的效果

馬 暢，梁 磊，張旭亮，尤金煒，劉 捷，惲時鋒

（南京軍區南京總醫院比較醫學科，全軍實驗動物科普與倫理教育基地，全國科普教育基地，南京 210002）

實驗應激致小鼠福利受損及音樂干預的效果

馬 暢，梁 磊，張旭亮，尤金煒，劉 捷，惲時鋒

（南京軍區南京總醫院比較醫學科，全軍實驗動物科普與倫理教育基地，全國科普教育基地，南京 210002）

目的探究常規實驗操作對動物福利的損傷程度以及音樂干預的效果。方法采用3周齡雄性ICR小鼠，實驗操作組分別給予保定（E-r）、灌胃（E-g）、腹腔注射（E-p）和眼眶靜脈叢采血（E-o）處理，音樂干預組采取相同處理后給予1h音樂干預（M-r，M-g，M-p，M-o）。連續處理7d后，測定與福利相關的神經內分泌、免疫、生化、生長指標和飼料能效比。結果①與對照組相比，實驗操作四組體增重和飼料能效比均顯著降低；E-r組TG、HDL-C、WBC、IL-2、β-EP和脾臟、胸腺指數均顯著降低，CORT、ACTH、EPI顯著升高；E-g組的TG、WBC、IL-2和β-EP顯著降低，CORT、ACTH和EPI顯著升高；E-p組IL-2顯著降低，CORT、ACTH和EPI顯著升高；E-o組脾臟指數和WBC顯著降低，CORT顯著升高。②與實驗操作組相比，M-r組體增重、飼料能效比、脾臟指數、IL-2顯著升高，CHOL、CORT、ACTH和β-EP均顯著降低；M-g組WBC顯著升高，CORT顯著降低；M-p組WBC顯著降低；M-o組飼料能效比顯著升高。結論四種常規實驗操作均對小鼠的健康福利造成了不同程度損傷，而音樂干預能夠改善小鼠的操作應激和福利損傷程度。

小鼠；實驗操作；福利損傷；音樂

常規的實驗操作（如保定、采血、給藥等）對實驗動物是一種身心復合應激，不僅會引起疼痛和不適，還會造成動物心理上的緊張和反抗情緒，這不但會影響動物的健康和福利，還會降低科研結果可靠性［1-2］。音樂是常用的環境修飾手段之一，可以調節生物的情緒，降低抑郁，緩解焦慮，改善神經、內分泌、心血管等系統功能，維持正常的生理與心理平衡［3］。實驗動物作為生命個體，同樣具有感知音樂的能力［4-5］。研究報道，非洲灰鸚鵡和葵花鳳頭鸚鵡會隨著音樂的節拍擺動頭部和抬腳［6］，音樂干預的奶牛日產奶量顯著增加［7］。但音樂干預在改善實驗動物福利，提高實驗動物生活質量等方面的報道鮮見。

本研究以ICR小鼠為實驗對象，使用常規的實驗操作（保定、采血、灌胃）處理小鼠，而后進行音樂干預，根據生長發育狀況、機體免疫功能和神經-內分泌系統的反應，探究小鼠的福利損傷情況以及音樂干預效果。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF級雄性ICR小鼠90只，3周齡，18～19g，由南京軍區南京總醫院比較醫學科提供【SCXK（軍）2012-0014】。

1.2 環境及飼養管理

實驗場所為南京軍區南京總醫院比較醫學科屏障環境【SYXK（軍）2012-0047】。小鼠飼料為江蘇協同醫藥生物工程有限責任公司提供60Co輻照全價顆粒飼料。

1.3 分組和處理

實驗共分3個大組，9個小組，每組10只，實驗期為7d，每天8：00、15：00開始實驗。

分組和處理如下：

對照組（untreated）N組：常規飼養，不予任何干預；

實驗操作組（experimental）E組：按照不同操作分為4個小組，每組10只

保定組（restraint）E-r組：參照翟亞南方法［8］，保定于自制束縛器內，每天8：00、15：00開始各保定1h，束縛器能限制小鼠肢體自由活動但不產生壓迫感，保定期間限食限水。其余時間常規飼養。

灌胃組（intragastric injection）E-g組：給予滅菌生理鹽水0.1mL，2次/日。

腹腔注射組（intraperitoneal injection）E-p組：腹腔注射滅菌生理鹽水0.1mL，2次/日。

眶靜脈采血組（orbital venous sampling）E-o組：眼眶靜脈叢采血0.1mL，1次/2日。

音樂干預組（music）M組：

同上述實驗操作四組，保定（M-r）、灌胃（M-g）、腹腔注射（M-p）和眼眶靜脈采血（M-o）各組小鼠在每次實驗操作處理后，給予1h音樂干預，調節音量使籠盒上方聲強為50±5dB。干預音樂為恬靜、柔和、舒緩的民樂和世界名曲，所選曲目為《春江花月夜》、《梁祝》、《藍色多瑙河》、《春之奏鳴曲》、《田園交響曲》、《北國之春》、《綠島小夜曲》，循環播放。音樂干預時各組小鼠正常飲食飲水。

1.4 樣本采集與指標測定

實驗期間，觀測各組小鼠的體重變化和飼料消耗情況，于每天最后一次處理后稱體重和當日飼料消耗總量，計算飼料能效比（FER）=實驗期間體增重（g）/實驗期間攝食總量（g）×100％。

實驗期結束，小鼠經尾靜脈采血20μL，于1h內上機測定外周白細胞計數（WBC）。眼眶采血，血樣室溫靜置30min后以4000r/min的速度離心10min，分離血清，進行生化檢測。余下血清于-40℃保存，ELISA法測定血清免疫因子。采集胸腺、脾臟，測量臟器系數。計算臟器系數=臟器重量（g）/體重（g）×100％。

1.5 主要試劑和儀器

Bio-red酶標儀，Sysmex Xs-800i血常規自動檢測儀，日立7600全自動生化分析儀。小鼠ELISA試劑盒為美國RayBiotech公司產品。

1.6 統計學處理

結果以均值±標準差表示，應用SPSS 17.0軟件進行統計分析，采用oneway ANOVA和Bonferroni法檢驗組間差異，檢驗水準P=0.05，P=0.01。

2 結果

2.1 生長和攝食的比較

見表1。與對照組相比，實驗操作四組體增重均顯著減少。音樂干預后，M-r組，M-p組，M-o組體增重均高于實驗操作組，其中M-r組差異顯著（P＜0.05）。

與對照組相比，E-g組、E-p組和E-o組的飼料能效比顯著降低（P＜0.05），E-r組極顯著降低（P＜0.01）。音樂干預后，M-r組和M-o組顯著升高（P＜0.05）。

2.2 血液生化的比較

見表2。與對照組相比，E-r組和E-g組的TG值顯著降低（P＜0.05），同時E-r組的HDL-C也顯著降低（P＜0.05）。音樂干預后，M-r組CHOL顯著降低（P＜0.05）。

表1 體增重與飼料能效比（n=10）Tab.1 Body weight gain and food efficiency ratio（n=10）

表2 血液生化測定結果（n=10）Tab.2 Results of measurements of bloodbiochemistry tests（n=10）

2.3 免疫學指標的變化

見表3。比對照組相比，實驗操作組脾臟指數均降低，其中E-o組脾臟指數顯著降低（P＜0.05），E-r組脾臟指數極顯著降低（P＜0.01），胸腺指數顯著降低（P＜0.05）。與實驗操作組相比，音樂干預組脾臟指數均有不同程度升高，其中M-r組差異顯著（P＜0.05）。胸腺指數無顯著變化。

WBC測定顯示，與對照組相比，實驗操作組中E-r組、E-g組和E-o組顯著降低（P＜0.05）。音樂干預后，M-g組顯著升高而M-p組顯著降低（P＜0.05）。

IL-2測定顯示，與對照組相比，實驗操作組中E-r組、E-g組和E-p組顯著降低（P＜0.05）。音樂干預后，M-r組顯著升高（P＜0.05）。

2.4 神經內分泌功能的變化與比較

見表4。與對照組相比，實驗操作四組的CORT和ACTH均不同程度升高，E-r組和E-g組β-EP顯著下降（P＜0.05），E-r組、E-g組和E-p組EPI顯著升高（P＜0.05）。

音樂干預后，M-r組CORT、ACTH和β-EP均顯著降低（P＜0.05）。M-g組CORT顯著下降（P＜0.05）。

表3 免疫學指標測定結果（n=10）Tab.3 Results of measurements of immunological index（n=10）

表4 血清CORT、ACTH、β-EP和EPI測定結果（n=10）Tab.4 Serum levels of CORT、ACTH、β-EP and EPI（n=10）

3 討論

長期的實驗處理給實驗動物帶來的生理痛苦和心理壓力以及累積效應是公認的福利損傷［9］，這種福利損傷是工作中不可避免的。因此，評價實驗動物福利損傷程度并采取有效措施改善是動物福利研究的重要內容。本研究參考目前探討較多的動物福利相關指標［10］，以小鼠體增重反映其生長發育水平，飼料能效比反映其攝食行為，以血清TP、CHOL和TC反映其物質代謝狀況，以主要免疫器官指數、外周血WBC計數、血清IL-2水平反映其基礎免疫狀況，以4種血清激素（細胞因子）含量變化反映其神經內分泌狀況，通過綜合評價這些指標的變化來探究實驗操作對動物福利的損傷程度以及音樂干預的效果。

生長和攝食結果顯示，實驗操作四組小鼠的體增重和飼料能效比均明顯降低，表明四種實驗操作已經損傷了小鼠福利。與實驗操作組相比，音樂干預組體增重和飼料能效比均有不同程度的改善，表明音樂干預可以通過改善食欲間接緩解小鼠在實驗操作下由于食欲減退而出現的機體能量和營養供需失衡狀態，此種效應在M-r組和M-o組體現較明顯，提示音樂干預可能對改善眼眶靜脈采血和保定小鼠的攝食及生長具有較好效果。

血清生化指標測定結果顯示，E-r組和E-g組的TG值均顯著降低，同時E-r組的HDL-C也顯著降低，提示保定和灌胃實驗刺激可能影響了小鼠體內的脂代謝過程，甚至可能影響到體內物質資源的重新分配。有研究報道，較低的血膽固醇濃度往往與抑郁傾向有關［11-12］，本研究結果顯示，M-r組CHOL值與實驗組相比顯著降低，提示保定應激小鼠可能出現情緒低落。推測情緒的潛在抑制可能有利于平復實驗動物受到刺激后過于亢奮的狀態，該可能性有待進一步驗證。

實驗結果顯示，實驗操作四組的脾臟指數均不同程度的降低，其中E-o組脾臟指數顯著降低，E-r組的脾臟指數和胸腺指數均顯著降低，提示7d的實驗操作應激已顯著影響到小鼠的免疫器官。已有研究表明，實驗操作可引起小鼠免疫抑制［13-15］，導致主要免疫器官退化，本實驗也確認了這一觀點。與實驗組相比，音樂干預組的胸腺指數均無顯著變化，但脾臟指數均有所上升。與E-r組相比，M-r組的脾臟指數下降趨勢減緩，表明音樂干預有緩解保定應激小鼠免疫器官衰退的作用。實驗操作組小鼠的外周血WBC和IL-2均有不同程度的降低，提示各種實驗操作刺激均已造成小鼠免疫功能不同程度的抑制。與實驗操作組相比，M-g組WBC和M-r組IL-2水平降低趨勢減緩，提示音樂干預對恢復灌胃和保定應激小鼠的免疫功能有較明顯作用，其確切機制和對各層次免疫功能的影響值有待驗證。此外，音樂干預M-p組WBC結果顯著下降，推測可能由于免疫系統間的相互調控，以及免疫系統和神經內分泌系統間的雙向信息傳遞機制的作用，綜合導致了免疫指標的變化趨勢并不一致。

在動物福利評價中，下丘腦-垂體-腎上腺（HPA）是經典的應激反應通路［17-18］，外周血中CORT和ACTH水平升高是HPA軸激活的主要生理學表現。前期研究表明，常規實驗刺激能夠引起HPA軸的級聯激活，導致腎上腺皮質釋放大量糖皮質激素（GC）并使其維持在較高水平［19］。當生物體應對環境挑戰時提高GC的循環水平有助于幫助維持機體在不同環境中的穩態，然而血液中持久的高水平GC會導致機體損傷，并可能削弱機體對外界環境的適應能力［20］。內阿片肽家族的重要成員β-EP已被證明和身心刺激存在某種聯動，為體內神經內分泌-免疫網絡的雙重調節因子，而且是作用最強的內源性鎮痛物質［21-22］。本研究結果顯示，實驗操作組小鼠外周血清中CORT和ACTH水平顯著升高而β-EP水平降低，證實四種實驗操作使小鼠體內HPA軸激活，不同程度改變了實驗小鼠相關神經內分泌系統活性，推測外周β-EP水平下降在一定程度上可引起網絡調節的紊亂以及可能改變動物的痛閾。與E-r組相比，M-r組CORT、ACTH和β-EP均顯著降低，提示音樂干預有利于緩解保定小鼠的神經內分泌反應使其免受保定應激的損害。

EPI為交感-腎上腺-髓質系統（SNS）反應的主要外周產物，SNS生理意義在于通過緊急動員以確保動物體內重要組織器官的血液供應，迅速提高機體的應激抵抗能力，然而SNS反應持續時間過長，可能導致多組織的缺血壞死和功能紊亂［23］。研究結果顯示，與實驗操作組相比，音樂干預組EPI水平均有下降趨勢，適當的音樂干預有助于小鼠血清EPI恢復正常水平。

研究結果明確了常規實驗操作（保定、給藥、采血）已對小鼠造成了強烈的應激，使其體增重和飼料能效比均顯著降低，神經內分泌系統出現紊亂，免疫功能受到抑制，使小鼠的健康和福利受到嚴重威脅。本研究也初步證實恬靜、舒緩的音樂干預能夠改善眼眶靜脈采血小鼠的攝食生長情況，對灌胃小鼠的免疫功能有較好的恢復作用，對保定應激小鼠的攝食生長、神經內分泌系統和免疫功能均有較明顯的恢復作用。證實不同實驗操作在各項指標上改善或調節程度的不同，不同的損傷方式采取不同福利干預方案或許會收到更好的效果。

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The study of impaired welfare induced by routine experimental procedures on mice and intervention effect of music

MA Chang，LIANG Lei，ZHANG Xu-liang，YOU Jin-wei，LIU Jie，YUN Shi-feng
（Department of Comparative Medicine，Nanjing General Hospital of Nanjing Military Command，Army Education Base of Science and Ethics of Experimental Animal，National Sciene Education Base，Nanjing 210002，China）

ObjectiveTo study the impaired-welfare induced by routine experimental procedures on mice and the effect of music intervention.Methods3week male ICR mice were divided into 9 groups.The experimental groups were treated by several experimental operations including restraint（E-r），intragastric injection（E-g），intraperitoneal injection（E-p）and orbital venous sampling（E-o）.The music intervention groups were given 1 hour music intervention after the same experimental operation（M-r，M-g，M-p，M-o）.After 7 days of continuous treatment，the main neuroendocrine，immune，biochemical parameters，body weight and food efficiency ratio（FER）were measured.Results①Compared with the untreated group，the body weight gain and FER were significantly decreased in such four experimental groups；TG，HDL-C，WBC，IL-2，β-EP，spleen index and thymus index were significantly decreased in the E-r group，in addition，CORT、ACTH and EPI were significantly increased；TG，WBC，IL-2 and β-EP were significantly decreased in the E-ggroup，and CORT，ACTH，EPI were significantly increased；IL-2was significantly decreased in the E-p group，and CORT，ACTH，EPI were significantly increased；The spleen index and WBC were significantly decreased in E-o group，and CORT was significantly increased.②Compared with the experimental groups，the body weight gain，FER，spleen index，IL-2 were significantly increased in the M-r group，and CHOL，CORT，ACTH，β-EP were significantly decreased；WBC was significantly increased in the M-g group，and CORT was significantly decreased；WBC was significantly decreased in the M-p group；FER was significantly increased in the M-o group.ConclusionThe four routine experimental procedures cause strong stress response in mice，and lead to health and welfare impaired.However，music intervention played an important role in stress injury improvement.

Mice；Experimental operation；Welfare impaired；Music

R-332

A

1671-7856（2015）11-0032-05

10.3969.j.issn.1671-7856.2015.11.008

南京軍區南京總醫院院管課題（2015061）。

馬暢（1986-），女，技師，碩士，研究方向：實驗動物福利倫理，E-mail：machang316@126.com。

惲時鋒（1965-），男，主任技師，博士，碩士生導師，研究方向：實驗動物與比較醫學，E-mail：yunshifeng1@163.com。

﹞2015-09-18