兩種飼用檸檬酸效果的體外評估方法研究

唐茂妍，林冬梅，陳旭東（.上海正正生物技術有限公司，上海　004；.河北工程大學農學院，河北　邯鄲　05608；.北京中農穎泰生物技術有限公司，北京　009）

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兩種飼用檸檬酸效果的體外評估方法研究

唐茂妍1，林冬梅2，陳旭東3
（1.上海正正生物技術有限公司，上海200433；2.河北工程大學農學院，河北邯鄲056038；3.北京中農穎泰生物技術有限公司，北京100193）

摘要：試驗通過對兩種檸檬酸物理特性、化學特性及其對飼料pH、系酸力和有害菌作用效果的評估，比較兩種飼用檸檬酸效果的差異。

關鍵詞：體外法；檸檬酸；評估體系

隨著歐盟對抗生素禁用條例的頒布，飼用抗生素替代品的研究日益深入，酶制劑、益生素、酸化劑、寡糖等飼用添加劑逐步受到廣大生產者和使用者的關注。其中，酸化劑作為無污染、無殘留的綠色添加劑，其應用研究已經成為熱點，如酸化劑作用的分子機理、不同酸化劑的作用效果對比、酸化劑的組合效應等[1-4]。然而，不同的試驗方法、產品組成、添加量和日糧之間的差異均導致研究結果不一致，甚至有些結果截然相反，這些都對酸化劑的使用者造成了困擾，在某種程度上也限制了飼用酸化劑的廣泛應用。同時，酸化劑的生產、流通和品質檢測控制等方面也缺乏統一標準，目前對于飼用酸化劑的評估還是使用傳統動物飼養試驗的方法，該方法不僅耗時、費力，并且干擾因素頗多。

本試驗設計了一套系統的體外評估方法，這一體系考慮了單體酸特性以及對飼料和有害菌的影響等問題，對復合酸制作時的單體酸選擇（或復合酸效果對比）作以探討，為原料酸的選擇與評估建立一種快速、準確的評估體系，從而為酸化劑的生產者、使用者和研究者提供理論支持。

1　材料與方法

1.1儀器與試劑

1.1.1儀器

電子天平（BT124S）、真空干燥箱（DZF-6020）、pH計（FE20K Plus）、微型植物粉碎機（FZ102）、磁力加熱攪拌器（79-1）、恒溫水浴鍋（H.HS4）、生化培養箱（SPX-150B-Z）、立式壓力蒸汽滅菌器（YXQ-LS-30S11）、酸式滴定管、堿式滴定管、平板（直徑約85 mm）、游標卡尺等。

1.1.2試劑

配制鹽酸溶液和氫氧化鈉溶液混合液1 mol·L-1。普通肉湯培養基（批號1303202）、營養瓊脂培養基（批號140211）、SS瓊脂培養基（批號140432）購自北京三藥科技開發有限公司。

1.1.3酸化劑

兩種檸檬酸產品（A和B，批號分別為20140221 和20140118）均來自上海正正生物技術有限公司。

1.1.4斷奶料

斷奶料購自遼寧禾豐牧業股份有限公司沈陽分公司（規格20 kg，批號20131212），飼料主要原料組成為谷實類、餅粕類、魚粉、碳酸氫鈣、石粉、微量元素等。

1.2試驗方法

1.2.1酸化劑水分含量測定

復合酸化劑通用要求（GB/T 22141-2008飼料添加劑復合酸化劑通用要求）中水分含量測定使用的是卡爾費休法，該方法在實際使用中要求較高，需掌握的關鍵控制點較多[5]。因而，在實際生產中，酸化劑水分含量測定方法多采用真空干燥法，具體操作：準確稱取樣品2～5 g（精確至0.000 1 g）置于烘至恒重的稱量皿中，放置于真空烘箱（70℃、真空度93.3～98.6 KPa）烘干5 h，之后取出于干燥皿冷卻30 min，稱重[6]。樣品水分含量的計算公式見式1。

樣品水分含量（%）=（樣品濕重-樣品干重）/樣品濕重×100。（1）

1.2.2總磷含量測定

酸化劑樣品中總磷含量測定按照GB/T 3149-2004食品添加劑磷酸的測定方法進行。

1.2.3溶液pH測定

稱取適量檸檬酸樣品，加入去離子水磁力攪拌，配制成1%水溶液，用pH計測定溶液pH。

1.2.4酸化劑緩沖容量測定

緩沖容量（mol·L-1·pH-1）的定義為β=Δb/ΔpH，其中Δb是單位體積緩沖液所加入的一元強堿的摩爾數，ΔpH是單位體積緩沖液加入一元強堿后pH的變化[7]。稱取適量兩種檸檬酸樣品，分別用去離子水、檸檬酸鈉配制濃度為0.1 mol·L-1pH為3.0的緩沖溶液100 mL，然后用氫氧化鈉溶液1 mol·L-1滴定，使pH達到4.0，記錄所用氫氧化鈉溶液的毫升數，以所消耗氫氧化鈉毫摩爾數作為緩沖溶液的緩沖容量。

1.2.5飼料pH和系酸力測定

飼料pH和系酸力測定方法參照Bolduan方法進行[8]。稱取風干斷奶仔豬飼料樣品（過60目標準篩）100 g放入燒杯中，加入去離子水200 mL，在恒溫水浴鍋中加熱至37℃，放在磁力攪拌器上攪拌，并插入溫度計，將溫度控制在（37±1）℃。將pH計電極插入溶液中，測定懸濁液pH。用1 mol·L-1鹽酸溶液稀釋溶液，逐步滴定至pH=4.0時所用鹽酸的毫升數即為該飼料的系酸力（所有測定在1 h之內進行完畢）。

在粉碎過篩（過60目篩）的斷奶仔豬日糧樣品中添加一定比例檸檬酸，混合均勻。按照以上方法，分別測定加酸后飼料的pH和系酸力。

1.2.6對有害菌抑制效果測定

根據張治錟管碟法的操作，在已滅菌平板中加入適量營養瓊脂，然后分別加入檢定菌液（大腸桿菌2×109cfu·mL-1，沙門氏菌2×108cfu·mL-1），用無菌曲玻棒使之均勻鋪于瓊脂表面，然后將牛津杯置于平板內，用滅菌加樣器將待檢酸化劑（1%）加入牛津杯。置于37℃恒溫培養箱中培養24 h后，用游標卡尺量取抑菌圈大小[9]。判定標準按照鄧來送的方法進行[10]。

2　結果與討論

2.1理化特性比較

通過對兩種檸檬酸理化特性各指標的分析，可知雖同樣為檸檬酸，其某些特性還是有顯著性差異。酸化劑理化特性包括感官檢測（顏色、氣味、流散性等）和水分、總磷含量測定等。測定酸化劑中磷含量，主要是考慮到對飼料配方中磷含量的影響，如果酸化劑中磷含量較高，則需在飼料配方中調整其他磷源的添加量[11]。兩種檸檬酸水分、總磷含量比較見表1。

由表1可知，兩種檸檬酸在物理特性方面無顯著差異（P>0.05），均為無色易吸濕結晶，流動性良好，有正常的檸檬酸味。兩種檸檬酸水分含量均<10%，兩者間無顯著性差異（P>0.05）；兩種檸檬酸磷含量約為0.2%，兩者間無顯著性差異（P>0.05）。

表1　兩種檸檬酸水分、總磷含量比較

2.2特定濃度溶液酸度評估

酸化劑對飼料pH、系酸力及消化道食糜酸度的影響主要取決于酸化劑酸度的強弱。一般可用兩種方法評估：一種方法是一定濃度水溶液的pH測定，此法可間接反映酸化劑的酸化能力，但是目前為止，還沒有確定適宜的酸化劑水溶液濃度，有研究認為1%酸化劑水溶液可反映實際情況[11]。另一種方法為在常用仔豬日糧中添加酸化劑后制成懸濁液測定其pH變化，這種方法在實際生產中有指導意義[12]。

唐湘方研究了6省18家有代表性的飼料企業的斷奶仔豬日糧pH、系酸力及電解質平衡情況，結果發現，斷奶仔豬日糧pH平均為5.91，但其變化范圍較大（5.47～6.95）[13]。飼料pH過高，一方面會更多中和胃酸，提高食糜pH，影響胃蛋白酶原的活化，造成消化不良；同時食糜pH升高，為有害菌繁殖和生長提供適宜條件，消化道菌群失衡導致動物細菌性腹瀉的發生。從另一方面講，飼料pH變化范圍增大，也增加了酸化劑針對性應用的困難。如果為降低飼料pH，則選用的單酸酸度系數就要低。兩種檸檬酸特定濃度水溶液pH比較見表2。

表2　兩種檸檬酸特定濃度水溶液pH比較

由表2可知，兩種檸檬酸1%水溶液pH均為2.01，兩者間沒有顯著差異（P>0.05）。

2.3酸化劑緩沖容量比較

飼料是由各種復雜的原料組成的緩沖體系，即對于外加的酸堿都有較強的緩沖作用，以保持飼料本身的pH不會發生太大變化。酸化劑一般都是由酸及其鹽組成的緩沖對，酸溶液緩沖容量的大小對于其作用的發揮也有著至關重要的作用。

本試驗中通過向具有相同pH的兩種檸檬酸緩沖液中滴加氫氧化鈉溶液（1 mol·L-1），以所用氫氧化鈉溶液的毫摩爾數評估兩種酸的緩沖容量大小，見圖1[7]。

圖1　兩種檸檬酸緩沖特性比較

由圖1可知，檸檬酸B的緩沖容量高于檸檬酸A，以此可推測，同樣飼料中分別添加這兩種檸檬酸，對于飼料pH和系酸力的影響，檸檬酸B優于檸檬酸A。

2.4對飼料pH的影響

研究表明，酸化劑的主要作用之一就是降低飼料和食糜的pH，從而抑制飼料中有害菌生長，并提高胃中蛋白酶活性，改善飼料中植物性蛋白的消化率，提高動物的生產性能[14]。因而測定加酸飼料pH的變化，成為評估酸化劑效果的重要指標之一。兩種檸檬酸對飼料pH和系酸力的影響見表3。

表3　兩種檸檬酸對飼料pH和系酸力的影響

由表3可知，特定斷奶飼料（pH=6.38）中分別添加檸檬酸A和檸檬酸B后，隨酸化劑添加量的增加，日糧pH有降低趨勢；添加量為0.5%時，添加檸檬酸B的飼料pH顯著低于添加檸檬酸A的飼料pH（P<0.05）。而在較低添加量時二者對于飼料pH的影響無顯著差異（P>0.05）。

2.5對飼料系酸力的影響

日糧系酸力（ABC），也稱酸結合能力，是指一定日糧中和酸的能力。Bolduan把系酸力定義為使100 g飼料日糧的pH降至4.0時所需要的鹽酸毫摩爾數[8]。多數研究認為，飼料系酸力在一定范圍內（19.5～23mmol·100g-1）可改善斷奶仔豬消化道食糜酸度，維持消化道菌群平衡，保證消化系統的正常生理功能，同時提高斷奶仔豬日增重和飼料效率[14-16]。

由表3可知，向特定斷奶豬飼料（系酸力為22.61 mmol·100 g-1）中分別添加0.3%和0.5%的兩種檸檬酸，隨著酸添加量增加，飼料系酸力顯著降低（P< 0.05）；同樣在0.5%添加量下，添加檸檬酸B的飼料系酸力低于添加檸檬酸A的飼料，而添加濃度為0.3%時，二者對飼料系酸力的影響差異不顯著（P> 0.05）。

2.6酸化劑在飼料中的緩釋

酸化劑的生產工藝不同對產品本身特性有顯著影響，有時為避免酸化劑與飼料中某些成分發生反應，影響其他飼料成分功效，需對酸化劑產品做后處理工藝，如包被等。包被技術原多用于醫藥產品中。包衣是藥劑學中最常用的的技術之一，是指在特定的設備中，按特定的工藝將能成膜的材料，涂覆在藥物固體制劑的外表面，使其干燥后成為緊密黏附在表面的一層或多層不同厚薄、不同彈性的功能保護層。在飼料添加劑中的應用則簡單的多，現在多為包被材料和芯材物理混合，使芯材外表面涂裹一層包被材料，從而防止芯材與其他成分發生反應。

兩種檸檬酸在飼料中的緩釋比較見圖2。本試驗中兩種檸檬酸以相同添加量分別添加到特定斷奶仔豬料中，加入適量去離子水制成懸濁液，測定不同時間點懸濁液的pH，隨時間延長，飼料pH逐漸降低，但1 h后，pH變化趨于平緩；兩種檸檬酸添加入飼料后pH變化趨勢相同，兩者無顯著差異（P>0.05）。

圖2　兩種檸檬酸在飼料中的緩釋比較

2.7酸化劑對有害菌的抑制效果

酸化劑添加除了降低飼料pH和系酸力外，還可抑制有害菌的生長。大腸桿菌和沙門氏菌是畜禽消化道中最常見的兩種致病菌，均屬于革蘭氏陰性菌。消化道菌群失衡很容易引起大腸桿菌和沙門氏菌的過度繁殖和生長，從而造成動物腹瀉下痢[17-21]。因而常以這兩種菌作為評價酸化劑作用效果的指標。兩種檸檬酸對有害微生物的抑制作用見表4。

表4　兩種檸檬酸對有害微生物的抑制作用mm

在液體培養基中加入相同濃度檸檬酸A和檸檬酸B，抑菌圈直徑大小顯示了二者對大腸桿菌和沙門氏菌抑制效果。由表4可知，檸檬酸對沙門氏菌的抑制效果優于對大腸桿菌的抑制，同時檸檬酸B對兩種有害菌的抑菌圈顯著>檸檬酸A（P<0.05）。

3　小結

常用的檸檬酸制備方法是微生物發酵法，因而產品的特性會受到菌種種類、發酵方法以及后處理工藝的影響。試驗所用同樣純度的檸檬酸產品，感官特性和物理特性沒有顯著差別，但兩種檸檬酸的化學特性、對飼料的影響和對有害菌的抑制效果均有顯著差異。綜合本研究所選取的檢測指標可以建立一種單酸（或復合酸）的快速評估體系，從而為飼料酸化劑的深入應用提供幫助。

本研究發現，在進行單酸或復合酸的體外評估時，可以通過單酸的化學指標（酸度、緩沖容量等）和對飼料和微生物的影響指標（飼料pH和系酸力變化、有害菌生長抑制效果）作為快速評定指標。

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前沿科技摘編

Study on Assessment the Effect of Two Citric Acid by in vitro Method

TANG Maoyan1, LIN Dongmei2, CHEN Xudong3
（1. Shanghai Zhengzheng Biotechnology, Co., Ltd., Shanghai 200433, China；2. College of Agriculture, Hebei University of Engineering, Handan 056038, Hebei China; 3. Beijing Sinagri Yingtai Biotechnology Co., Ltd., Beijing 100193, China）

Abstract:By assessing the physical properties, chemical properties of two citric acids, pH, acid-binding capaci?ty and harmful bacteria effect of feed,the effect of two citric acids were compared.

Key words:in vitro method; citric acid; evaluation system

作者簡介：唐茂妍（1976-），女，山東煙臺人，博士，主要從事酸化劑的定量應用研究。

收稿日期：2015-03-20

中圖分類號：S816.7

文獻標志碼：A

文章編號：1001-0084（2015）05-0001-05