葡聚糖凝膠在FD—1—1項目中的應用

陳輔辰

摘 要：本文通過對比幾種常見凝膠的理化性質，詳細介紹了葡聚糖凝膠的篩選及在FD-1-1項目中的應用。

關鍵詞：葡聚糖凝膠；分配系數；凝膠處理；裝柱；上樣；洗脫

凝膠過濾層析是生化分離常用色譜技術的一種，凝膠層析的固定相是惰性的珠狀凝膠顆粒，凝膠顆粒的內部具有立體網狀結構，形成很多孔穴。當蛋白質分子通過裝有凝膠顆粒的色譜柱時，根據它們分子大小不同而進行分離的技術。

1 葡聚糖凝膠技術的原理

凝膠顆粒內部具有多孔網狀結構，被分離的混合物流過層析柱時，比凝膠孔徑大的分子不能進入凝膠孔內，在凝膠顆粒之間的空隙向下移動，并最先被洗脫出來；比網孔小的分子能不同程度的自由出入凝膠孔內外，在柱內經過的路程較長移動速度較慢，最后被洗脫出來。

2 葡聚糖凝膠（Sephadex）的種類和性質

凝膠層析法適用于分離和提純蛋白質、酶、多肽、激素、多糖、核酸類等物質。分子大小彼此相差25%的樣品，只要通過單一凝膠床就可以完全將它們分開。利用凝膠的分子篩特性，可對這些物質的溶液進行脫鹽、濃縮、去熱源和脫色。

SephadexG ：G 后的數字為凝膠吸水值的10倍。G 反應凝膠的交聯程度、膨脹程度和分部范圍。根據不同的吸水值主要有：Sephadex G-1O、Sephadex G-15、Sephadex G-25、Sephadex G-50、Sephadex G-75、SephadexG-150、Sephadex G-200。

3 分配系數（Kd）：Ve=Vo+Kd·Vi

每個溶質分子在流動相和固定相之間有一個特定的分配系數。

Vo簡稱為外水體積，Vo等于被完全排阻的大分子的洗脫體積。可以用一個已知相對分子質量遠超過凝膠排阻極限的有色分子，如常用的藍色葡聚糖-2000溶液通過柱床，即可測出柱床的外水體積Vo。

Vi簡稱內水體積，可由g.Wr求得（g為干凝膠質量，單位為g，Wr為凝膠吸水量，以mL/g表示）。Vi也可以從洗脫一種完全不受凝膠微孔排阻的小分子溶質（如重鉻酸鉀）的洗脫體積Ve計算，即對某物質在凝膠柱內洗脫體積Ve、Vo和Vi之間的關系可用下式表示： Ve=Vo+Kd·Vi。式中Ve為脫體積，它包括自加入樣品時算起，到組分最大濃度出現時所流出的體積。Kd為每個溶質分子在流動相和固定相之間的一個特定的分配系數，它只與被分離物質分子大小和凝膠顆粒內孔隙大小分布有關。Kd可通過實驗由Ve、Vo和Vi求得。

當Kd=0時，Ve=Vo，說明這種溶質相對分子質量大，完全不能進入凝膠顆粒微孔內，被排阻于凝膠顆粒之外而最先洗脫下來；但實際上，約有1/5的內水因溶劑化作用而呈水合狀態，妨礙小分子的自由擴散。故實際上Ve小分子 =Vo+0.8Vi；當0

4 葡聚糖凝膠的應用

4.1 裝柱

一般選用細長的拄作凝膠過濾。進行脫鹽時，柱高50cm比較合適；分級分離時，100cm就足夠了。 一般是在柱內先裝入約1/3高度的水或緩沖液，然后將溶脹好的凝膠在攪拌成稀漿的情況下慢慢倒入柱內，使其自然沉降。如此連續操作，可以得到一個均勻的柱床。柱裝得不好往往造成洗脫區帶加寬，甚至使一些本來可以分開的區帶重疊。如裝柱時的操作壓力太大，會使凝膠床壓得太實，從而降低流速。

新柱裝好后，要用洗脫緩沖液平衡，一般用3～5倍體積的緩沖液在恒壓下流過柱床。

新裝好的柱要檢驗其均勻性-可用帶色的高分子物質如藍色葡聚糖-2000配成2mg/mL的溶液過柱，觀察色帶是否均勻下降。也可以對光檢查，看其是否均勻或有無氣泡存在。

4.2 加樣

由于凝膠層析的稀釋作用，似乎樣品濃度應盡可能大才好，但樣品濃度過大往往導致粘度增大，而使層析分辨率下降。一般要求樣品粘度小于0.01Pa.s（帕斯卡秒），這樣才不致于對分離造成明顯影響。對蛋白質類樣品濃度以不大于4%為宜。如果樣品渾濁，應先過濾或離心除去顆粒后上柱。分析用量一般為每100mL床體積加樣品1～2mL，制備用量一般為每100mL床體積加樣品20～30mL，這樣可使樣品的洗脫體積小于樣品各組分之間的分離體積，獲得較滿意的分離效果。

（1）加葡萄糖2 000，使終濃度為5%，相對粘度11.8；（2）加葡萄糖2 000，使終濃度為2.5%，相對粘度4.2；（3）加葡萄糖2 000，使終濃度為1%。

樣品與柱床體積比例懸殊時分離效果好，但過少的樣品量不但會造成設備和器材的浪費，降低工作效率，還會造成樣品稀釋。樣品上柱是凝膠層析中最關鍵的一步。理想的樣品色帶應是狹窄且平直的巨型色譜帶。為了做到這一點，應盡量減少加樣時樣品的稀釋以及樣品的非平流流經凝膠層析床體。反之將造成色譜帶擴散、紊亂，嚴重影響分離效果。加樣時應盡量減少樣品的稀釋，及凝膠床面的攪動。這一點在分級分離時尤為重要，應嚴格按一定的操作程序進行，通常有下列三種方法：（1）.直接將樣品加到層析床表面。（2）.利用兩種液體比重不同而分層的原理，將高比重樣品加入床表面低比重的洗脫液之中，樣品就慢慢均勻地下沉于床表面，再打開出口，使樣品滲入層析。（3）.可用微量泵控制。

4.3 洗脫

為了防止柱床體積的變化，造成流速降低及重復性下降。整個洗脫過程中始終保持一定的操作壓，并不超限是很必要的。流速不宜過快且要穩定。冼脫液的成分也不應改變，以防凝膠顆粒的漲縮引起柱床體積變化或流速改變。在許多情況下可以用水作洗脫劑，但為了防止非特異吸附，避免一些蛋白質在純水中難以溶解（析出沉淀），以及蛋白質穩定性等問題的發生，常采用緩沖鹽溶液進行洗脫。離子濃度至少0.02mol/L方可獲得較好的結果，因為凝膠含有少量羧基，會吸附少量陽離子而排斥少量陰離子。洗脫用鹽等介質應比較容易除去才好，通常，氨水、醋酸、甲酸銨等易發揮的物質用得較多。對一些吸附較強的物質也可采用水和有機溶劑（如水-甲醇，水-丙酮等）的混合物進行洗脫。

4.4 凝膠的再生和保養

在洗脫過程中，所有組分一般都可被洗脫下來，所以裝好柱后，可反復使用，無需特殊的再生處理。但多次使用后，凝膠顆粒可能逐漸沉積壓緊，流速變慢。這時只需將凝膠自柱內倒出，重新填裝。或使用反沖法，使凝膠松散沖起，然后自然沉降，形成新的柱床，這樣流速會有所改善。葡萄糖凝膠和瓊脂糖凝膠都是碳水化合物，能被微生物（如細菌和霉菌）分解。聚丙烯酰胺凝膠本身不被微生物作用，但微生物還是能在此凝膠液中和凝膠床上生長，這樣會破壞凝膠的特性，影響分離效果。

為防止細菌生長和發酵，可用0.02%疊氮化鈉、0.05%三氯叔丁醇（僅在弱酸有效，也適用于其他離子交換劑）或0.002%洗必泰、0.01%醋酸苯汞（在弱堿中有效，也適用于其他陰離子交換劑）以及0.1mol/L氫氧化鈉溶液等作防腐劑。層析前再用水或平衡液將防腐劑洗去。凝膠用過后，有幾種保存方法：⑴濕態保存：在水相中加防腐劑，或水洗到中性，高壓滅菌封存（或低溫存放）；⑵半收縮保存：水洗后濾干，加70%乙醇使膠收縮，再浸泡于70%乙醇中保存；⑶干燥保存：水洗后濾干，依次用50%、70%、90%、95%乙醇脫水，再用乙醚洗去乙醇，干燥（或60～80℃烘干）后保存。加乙醇時，切忌一上來就用濃乙醇處理，以防結塊。

5 葡聚糖凝膠技術在FD-1-1項目中的應用

由于FD-1-1項目批產量比較小，葡聚糖凝膠技術具有操作條件溫和，樣品回收率可接近100%，并且重復性高；作為脫鹽手段，與透析法相比速度快、精度高；與超濾法相比，蛋白活性收率高；分離機理簡單，操作參數少，容易規模放大等特點，在FD-1-1項目中得到了廣泛應用。

在N2-N1的反應中，利用葡聚糖凝膠技術除去了樣品中小分子的雜質。在成品的純化中，由于制備液相流動相是鹽溶液，在除鹽過程中也用到了葡聚糖凝膠技術。由于FD-1-1項目批產量比較小，葡聚糖凝膠技術具有操作條件溫和，樣品回收率可接近100%，并且重復性高，因此葡聚糖凝膠技術在FD-1-1項目中得到了廣泛應用。

參考文獻

[1] C.J. Jones， C.K. Larive， Cracking the proteoglycan code， Nat. Chem. Biol. 7 （2011）758–759.