脾虛證模型大鼠外觀表征和神經功能態及不同健脾方作用的比較?

張廣霞，謝 鳴，劉碧原，張媛鳳

(北京中醫藥大學方劑學學科，北京 100029)

脾虛證模型大鼠外觀表征和神經功能態及不同健脾方作用的比較?

張廣霞，謝 鳴△，劉碧原，張媛鳳

(北京中醫藥大學方劑學學科，北京 100029)

目的:比較中醫補脾類方對脾虛證模型大鼠外觀表征和神經功能狀態的影響。方法:大鼠按隨機數字表法分為正常組、模型組、補中益氣湯組、四君子湯組、參苓白術散組，采用飲食失節+過度疲勞法復制脾虛模型。實驗期間觀察各組大鼠外觀行為、體質量、體溫變化和外周血相關指標。結果:較之于正常對照組，模型組大鼠出現外觀行為異常，體質量、體溫、血漿cAMP、Ach及cAMP/cGMP比值均降低，cGMP升高。較之于模型組，各給藥組大鼠體質量、體溫、cAMP及cAMP/cGMP升高，外觀行為變化積分和cGMP降低，補中益氣湯組和參苓白術散組Ach升高。三方組間比較，補中益氣湯組體溫和cAMP/cGMP均較其他兩組升高，參苓白術散組Ach較其他兩組升高。結論:補脾三方對脾虛證大鼠的脾虛癥狀、體溫及植物性神經功能失調均有不同程度的改善作用，但對癥狀群的改善及對交感神經/副交感神經功能的調整各有側重。

方證相關;脾虛證;健脾類方;外觀行為;神經功能態

“方證相關”是中醫辨證論治的重要命題之一，也是方劑學學理的邏輯基礎［1］。方證相關是指中醫辨證論治經驗中方與證存在著不同程度的關聯，即一個證常可以容許多個方劑治療，而同一方劑也可用于多證的治療，但獲得最好療效則應是與特定病證的病機具有高度關聯的方劑。四君子湯、參苓白術散、補中益氣湯是中醫健脾的三首代表方，三方因藥味組成不同，雖同有健脾功效，但在養胃和中、滲濕止瀉、升陽退熱方面各有偏頗;3方主治雖均涉脾虛證，但各方所主證的病機有所側重。本文基于中醫“方證相關”學理［1］，在觀察脾虛證模型大鼠外觀行為表征、體質量、體溫及植物性神經功能態的基礎上，試從同證異方的角度，比較觀察四君子湯、參苓白術散、補中益氣湯三方對該脾虛大鼠模型的相關作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗藥物 人參、黃芪、白術、炙甘草、當歸、柴胡、陳皮、升麻、茯苓、蓮子肉、薏苡仁、砂仁、桔梗、白扁豆、山藥共15味，均由北京同仁堂藥業股份有限公司提供，并鑒定為正品，藥物組成參考《方劑學》五版教材。四君子湯(人參10 g，白術9 g，茯苓9 g，炙甘草6 g)、補中益氣湯(黃芪18 g，人參10 g，當歸10 g，白術10 g，陳皮6 g，炙甘草5 g，柴胡3 g，升麻3 g)、參苓白術散(蓮子肉6 g，薏苡仁6 g，砂仁3 g，桔梗3 g，白扁豆6 g，茯苓9 g，人參9 g，炙甘草5 g，白術9 g，山藥9 g)，分別采用常規水煎提取方法制成顆粒，使用前以蒸餾水配置成濃度為100%的口服液。

1.1.2 動物 雄性SPF/AVFWistar大鼠210 g～220 g(動物許可證號SCXK(京)2012－0001)，由北京維通利華實驗動物中心提供，適應性飼養7 d。

1.1.3 儀器 電子天平，北京北方首衡電子產品有限公司;塑料鋼化桶，高60 cm，桶口徑50 cm (執行標準為Q/WHC02－2002)，溫嶺大溪宏程塑料制品廠生產;數字溫度計(MC－3B型)，OMROM歐姆龍(大連)有限公司生產。

1.2 方法

1.2.1 模型制作 大鼠適應性飼養7 d后進行預游泳，剔除游泳時間少于10 min、大于20 min的大鼠，采用飲食失節+游泳疲勞法［2］復制脾虛證大鼠模型，即合格大鼠每天2∶00 pm置于盛有溫水(22±1℃)的塑料鋼化桶中游泳10 min，隔日喂食(隔日禁食不禁水，隔日足量給食)，連續28 d。

1.2.2 分組與處理 合格大鼠按隨機數字表法分為空白對照組(10～12只)和造模組(48只);造模組大鼠按上述方法造模2周后，按隨機數字表法分為脾虛模型組、補中益氣湯組、四君子湯組、參苓白術散組共4組，每組各12只。中藥3組大鼠均按4.05 g/kg(相當于生藥材含量，分別按處方人用量與大鼠體質量換算而成)分別給予補中益氣湯、四君子湯、參苓白術散口服液灌胃，每日1次，連續14 d。于造模第29天腹腔注射10%水合氯醛(0.35 ml/100 g體質量)麻醉，腹主動脈取血6 ml于抗凝管中充分混勻，2000 rmp 10 min取血漿，測定Ach、cAMP和cGMP含量。

1.2.3 體質量和外觀行為學評分 ①外觀行為觀測:記錄各組每只大鼠的外觀行為變化，每周記錄2次(周三和周日)，按以下評分標準［3］。計算各行為指標的分值，取每周2次均值作為每周的行為變化分值;分別將行為狀態與活躍程度、飲食狀態與大便狀態合并為活動狀態1、飲食大便2、皮膚毛發為3，即3組癥群，計算各組大鼠3組癥群的積分及其總積分;②體質量和體溫:每周二8∶00～8∶30稱量大鼠體質量，8∶30～9∶30測量大鼠肛門溫度。

表1 大鼠外觀行為評分標準

1.2.4 外周血Ach、cAMP和cGMP含量測定血漿Ach、cAMP和cGMP含量按放免法測定。

1.2.5 統計學方法 采用 SPSS 20.0 FOR WINDOWS軟件進行統計分析，各組數據均以均數±標準差(±s)表示，行單因素方差分析后，多組間比較采用Student Newman Keuls Test檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 脾虛證模型大鼠外觀行為變化及健脾三方的作用

表2、3顯示，實驗期間各時間段的空白對照組大鼠外觀行為未見明顯變化。造模2周后，脾虛模型組大鼠逐漸出現活動減少、扎堆甚至倦臥、大便稀溏、毛發枯亂、飲食減少等變化，計算各不同時間點的行為變化積分。與模型組比較，三方給藥2周后，各組大鼠的行為均有不同程度改善，計算實驗第4周時各組行為變化分值和總積分值。

表2 脾虛模型大鼠不同時間點各組癥群分值變化比較(±s，n=10)

表2 脾虛模型大鼠不同時間點各組癥群分值變化比較(±s，n=10)

注:與正常對照組同時間點比較:＊＊P＜0.01(1=活動狀態，2=飲食大便，3=皮膚毛發)

組 別 癥群 1周 2周 3周 4周0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.17±0.18正常對照組 2 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.25±0.07 3 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.20±0.08 1 0.25±0.00＊＊ 1.50±0.28＊＊ 2.00±0.00＊＊ 2.00±0.00＊＊脾虛模型組 2 0.25±0.00＊＊ 1.25±0.35＊＊ 2.00±0.00＊＊ 2.00±0.00＊＊3 0.125±0.00＊＊ 0.75±0.00＊＊ 1.65±0.00＊＊ 2.00±0.00 1＊＊

表2顯示，實驗期間正常組大鼠外觀行為的積分變化不大。與正常組比較，脾虛模型組大鼠造模從第1周至第4周的外觀行為積分值均見升高，差異有統計學意義(P＜0.01)。

表3顯示，與正常組比較，實驗第4周模型組大鼠的活動狀態、皮膚毛發、飲食大便、總積分分值均明顯增加，差異均有統計學意義(P＜0.05);與模型組比較，健脾三方干預2周后，各組大鼠的活動狀態、皮膚毛發、飲食大便及總積分分值均見下降，差異均有統計學意義(P＜0.05);三方組間比較，補中益氣湯組大鼠的活動狀態、皮膚毛發和總積分分值較其他兩方降低，差異均有統計學意義(P＜0.05);參苓白術散組的飲食大便分值較其他兩方組降低，總積分值較四君子湯組降低，差異有統計學意義(P＜0.05)。

表3 各組大鼠第4周各癥群分值變化(±s，n=10)

表3 各組大鼠第4周各癥群分值變化(±s，n=10)

注:與正常組比較:＊＊P＜0.01;與脾虛模型組比較:▲▲P＜0.01;與補中益氣湯組比較:●●P＜0.01，與四君子湯組比較:■■P＜0.01

組行為活動 皮膚毛發 飲食大便 總積分值正常對照組別0.31±0.08 0.28±0.10 0.31±0.07 0.90±0.16脾 虛 模 型 組 1.54±0.17＊＊ 1.61±0.15＊＊ 1.73±0.23＊＊ 4.88±0.30＊＊補中益氣湯組 0.74±0.04▲▲ 0.74±0.04▲▲ 0.87±0.06▲▲ 2.36±1.36▲▲四 君 子 湯 組 1.18±0.07▲▲●● 1.25±0.14▲▲●● 0.87±0.08▲▲ 3.31±0.25▲▲●●參苓白術散組 1.17±0.07▲▲●● 1.24±0.15▲▲●● 0.68±0.07▲▲●●■■ 3.01±0.25▲▲●●

2.2 脾虛證模型大鼠體質量和體溫變化及健脾三方的作用

表4、5顯示，實驗期間正常組大鼠體質量逐漸增加、體溫變化不大。與正常組比較，脾虛模型組和三方各組(未給藥前)大鼠造模第1周和第2周后的體質量和體溫均見降低，差異均有統計學意義(P＜0.01)。與模型組比較，給藥1周和2周后，三方各組大鼠的體質量、給藥1周后補中益氣湯組體溫、給藥2周后3方各組大鼠體溫均見不同程度增加，差異均有統計學意義(P＜0.01或P＜0.05)。三方組間比較，給藥1周和2周后各組大鼠體質量差異均無統計學意義(P＞0.05);補中益氣湯組大鼠的體溫較其他兩方組增加，差異均有統計學意義(P＜0.01)。

表4 不同時間點各組大鼠體質量變化比較(±s，g)

表4 不同時間點各組大鼠體質量變化比較(±s，g)

注:與正常對照組同時間點比較:＊＊P＜0.01;與脾虛模型組同時間點比較:▲P＜0.05，▲▲P＜0.01

組別 例數 1周 2周 3周 4周正常對照組 10 337.0±16.71 386.3±23.77 411.2±24.53 436.1±27.96脾虛模型組 10 290.3±10.34＊＊ 309.4± 6.49＊＊ 318.0±17.83＊＊ 325.3±14.06＊＊補中益氣湯組 10 290.9±15.81＊＊ 309.3±14.63＊＊ 345.5±19.79▲ 366.1±20.76▲▲四君子湯組 10 291.7±10.83＊＊ 307.7±13.31＊＊ 341.5±16.35▲ 355.7±15.90▲▲參苓白術散組 10 291.5± 9.73＊＊ 309.7±12.86＊＊ 346.2±23.36▲ 360.8±23.30▲▲

表5 不同時間點各組大鼠體溫(T)變化比較(±s，℃)

表5 不同時間點各組大鼠體溫(T)變化比較(±s，℃)

注:與正常對照組同時間點比較:＊＊P＜0.01;與脾虛模型組同時間點比較:▲P＜0.05，▲▲P＜0.01;與補中益氣湯組同時間點比較:●●P＜0.01

組別 例數 1周 2周 3周 4周正常對照組 10 37.15±0.51 37.23±0.33 37.14±0.23 37.49±0.27脾虛模型組 10 36.39±0.18＊＊ 36.20±0.13＊＊ 36.06±0.23＊＊ 35.65±0.66＊＊補中益氣湯組 10 36.46±0.18＊＊ 36.28±0.11＊＊ 36.49±0.14▲▲ 36.75±0.19▲▲四君子湯組 10 36.43±0.15＊＊ 36.18±0.10＊＊ 36.16±0.34 36.03±0.17▲●●參苓白術散組 10 36.45±0.21＊＊ 36.27±0.15＊＊ 36.16±0.22 36.04±0.17▲●●

2.3 各組大鼠血中Ach、cAMP、cGMP的變化及健脾三方的作用

表6顯示，與正常組比較脾虛模型組大鼠血中Ach降低，差異有統計學意義(P＜0.01);cAMP和cGMP分別降低和升高，cAMP/cGMP比值降低，差異有統計學意義(P＜0.05或P＜0.01)。與模型組比較，三方各組大鼠血中Ach均有不同程度降低，其中補中益氣湯和參苓白術散升高顯著，差異有統計學意義(P＜0.05或 P＜0.01);cAMP和cGMP分別呈升高和降低，cAMP/cGMP比值升高，差異有統計學意義(P＜0.01)。三方組間比較，參苓白術散組Ach較其他兩方均升高;補中益氣湯組血中cAMP和cGMP較其他兩方組呈升高和降低，cAMP/cGMP比值升高，差異有統計學意義(P＜0.05或P＜0.01);四君子湯組cAMP/cGMP比值較參苓白術散組升高，差異有統計學意義(P＜0.05)。

3 討論

本學科曾根據中醫“饑飽失常、腸胃乃傷”和“勞則傷脾”的中醫發病學理論，采用飲食失節+過度疲勞法復制出大鼠脾虛證模型，并觀察到該模型大鼠出現類中醫脾虛證的外觀行為變化［3－5］。本研究對大鼠外觀行為觀察指標進一步進行了分值確定和歸類處理，以提高其結果的準確性。實驗觀察到，脾虛模型大鼠于實驗第2周即出現活動減少、喜扎堆、食少便溏、皮毛不順等變化，隨時間的延長各組指標的積分不斷增加，至第4周變化總積分明顯增加，且出現明顯的動作遲緩、倦臥、毛發不澤、飲食減少、大便稀溏、形體消瘦、體質量明顯降低等類中醫脾虛之象。

表6 各組大鼠血漿Ach、cAMP、cGMP及比值變化比較(±s，n=10)

表6 各組大鼠血漿Ach、cAMP、cGMP及比值變化比較(±s，n=10)

注:與正常對照組比較:*P＜0.05，＊＊P＜0.01;與脾虛模型組比較:▲P＜0.05，▲▲P＜0.01;與補中益氣湯組比較:●P＜0.05，●●P＜0.01;與四君子湯組比較:■P＜0.05，■■P＜0.01

組別Ach(ug/ml) cAMP(nmol/l) cGMP(nmol/l)cAMP/cGMP正 常 對 照 組 881.17± 75.47 33.42±1.72 8.70±0.76 3.86±0.23脾 虛 模 型 組 563.19± 29.10＊＊ 30.80±2.02* 9.54±0.16* 3.25±0.27＊＊補中益氣湯組 635.57± 59.21▲ 39.79±1.74▲▲ 6.26±0.60▲▲ 6.38±0.37▲▲四 君 子 湯 組 596.44± 13.77 35.75±1.96▲▲●● 6.77±0.88▲▲ 5.33±0.50▲▲●●參苓白術散組 947.83±116.71▲▲●●■■ 36.99±3.87▲▲● 7.44±0.63▲▲●● 4.97±0.16▲▲●●■

植物性神經又稱自主神經，在調節內臟器官的功能及維持機體內外環境的平衡中發揮著重要作用。乙酰膽堿是副交感神經的重要遞質，血漿cAMP、cGMP也常被作為交感功能活性的敏感指標［6］。當體內cAMP、cGMP及比例失衡時，植物神經功能出現紊亂［7］，而體溫的上升和下降也與交感神經和副交感神經興奮狀態有關［8］。臨床曾觀察到，脾虛證患者伴有植物神經功能紊亂，其交感神經興奮性降低，副交感神經興奮性偏亢［9－10］;實驗也觀察到，用大黃水煎液灌胃7 d后復制出的脾虛證大鼠血漿中cAMP和cAMP/cGMP比值降低，cGMP升高［11－12］，提示中醫脾虛證與植物性神經功能異常有關。本實驗也觀察到，采用飲食失節和游泳疲勞的方法造模4周的脾虛證大鼠，在出現類似脾虛外觀行為表征的同時，血中cAMP含量降低，cGMP含量升高，cAMP/cGMP比值降低，且Ach降低，表明該模型存在植物性神經功能異常，即交感神經功能低下和副交感神經功能偏亢，影響其消化吸收功能，故出現食欲減退、體質量與體溫減低、皮毛不澤、扎堆少動及便溏泄瀉等變化。

四君子湯是健脾益氣的基本方，參苓白術散和補中益氣湯均由其加味變化而成。三方同有益氣健脾之功，但參苓白術散兼能和胃滲濕，補中益氣湯尤能升陽舉陷。從具體配伍用藥來看，三方中以補中益氣湯健脾益氣作用最強，參苓白術散居中，四君子湯次之。

本實驗觀察到，補脾三方作用于脾虛證模型大鼠2周后，各組的外觀行為、體質量、體溫及反映植物性神經功能的指標均有不同程度改善，表明三方均有一定改善脾虛癥狀和調整植物性神經功能的作用。但三方的作用各有不同，如四君子湯對外觀行為諸證有一定的改善，但對脾虛大鼠血中Ach無明顯影響;參苓白術散對外觀表現中食少和便溏的改善作用更為明顯，且對血中Ach的作用明顯優于四君子湯和補中益氣湯;補中益氣湯對外觀表現中活動減少和毛發不榮有更好的改善作用，且對體溫和血中cAMP的作用明顯優于四君子湯和參苓白術散，表明三方在改善脾虛證相關指標或病理環節上各有側重，同時也提示參苓白術散和胃滲濕與調節迷走神經、補中益氣湯升陽舉陷與調節交感神經的功能更為密切。從三方對脾虛指標的綜合作用來看，補中益氣湯的作用更為廣泛和明顯，參苓白術散則次之，四君子湯較弱，此與三方用藥配伍及健脾益氣功用強度有所不同的經驗認識相一致。

綜上所述，四君子湯、參苓白術散、補中益氣湯對脾虛模型大鼠的脾虛癥狀均有不同程度改善作用，但對脾虛證候中不同癥群的作用有一定的側重;三方對脾虛大鼠失調的植物性神經功能狀態均有不同程度的調整作用，但對交感神經和副交感神經功能的作用則各有偏頗，本研究為中醫類方配伍及其功效的同異理解提供了一定的現代藥理學依據。

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Comparison of the Appearance and function of Nervous Function and the Effect of Different Kinds of Invigorating Spleen Prescription in Rats with Spleen Deficiency Syndrome Model

ZHANG Guang－xia，XIE Ming△，LIU Bi－yuan，ZHANG Yuan－feng
(Formulary Department，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100029，China)

Objective:To compare the effects of different reinforcing spleen recipes on the appearance representations and nerve function in rats with spleen－deficiency syndrome.Method:The male wistar rats were randomly assigned into the normal group(group 1)，the spleen－deficiency group，Buzhong Yiqi Decoction group(group 3)，Si Junzi Decoction group (group 4)，Shenling Baizhu Powder group(group 5).Rats of group 3，4 and 5 had been respectively fed with medicine of Buzhong Yiqi Decoction，Si Junzi Decoction，Shenling Baizhu Powder 4.05 g·kg－1for two weeks.The ones of the group 1 and 2 were fed with equivalent physiological saline for two weeks.All the changes in behavior，body weight and temperature were observed and recorded.On the 29thday，all rats of plasma levels of 3’，5’－cyclic adenosine monophosphate (cAMP)，3’－5’－cyclic guanosine monophosphate(cGMP)and achtylcholine(Ach)were detected.Result:Compared with normal group，the model rats shown the abnormal of behavior and the weight，body temperature，plasma cAMP，Ach and cAMP/cGMP decreased significantly，cGMP increased significantly.Compared with model group，The weight，body temperature，cAMP and cAMP/cGMP of the three medicated groups all increased significantly，the behavior of integral value and cGMP decreased significantly.Plasma Ach increased significantly in group 3 and 5.Compared with group 4 and 5，the temperature，cAMP and cAMP/cGMP increased significantly in group 3，compared with group 3 and 4，the Ach increased significantly in group 5.Conclusion:Three different reinforcing spleen recipes on the spleen－deficiency symptoms，temperature and vegetative nerve function of rats model with spleen－deficiency syndrome had marked improvement，however，to improve different types of schizophrenia，sympathetic and parasympathetic nervous systems function had particular focuses respectively.

Relativity between formula and syndrome;Spleen－deficiency syndrome;Reinforcing spleen recipes; Appearance representations;Nerve Function

R285.5

:B

:1006－3250(2015)12－1503－04

2015－03－18

國家自然科學基金資助項目(81173193)

張廣霞(1987－)，女，內蒙古赤峰人，醫學碩士，從事方證相關及復方物質基礎的研究。

△通訊作者:謝 鳴，男，安徽安慶人，教授，Tel:010－64286992，E－mail:xieming603@263.net。