白色念珠菌腸道感染對(duì)脾虛小鼠小腸組織中Perforin和Granzyme的影響?

馬賢德，韓曉偉，關(guān)洪全

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，沈陽(yáng) 110032)

白色念珠菌腸道感染對(duì)脾虛小鼠小腸組織中Perforin和Granzyme的影響?

馬賢德，韓曉偉，關(guān)洪全△

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，沈陽(yáng) 110032)

目的:通過(guò)對(duì)脾虛感染白色念珠菌小鼠小腸超微結(jié)構(gòu)及黏膜組織中Perforin、Granzyme表達(dá)水平的觀察，探討機(jī)體在脾虛狀態(tài)下感染白色念珠菌的部分免疫機(jī)制。方法:健康SPF級(jí)昆明種小白鼠60只，按隨機(jī)數(shù)字表法分為空白對(duì)照組(N1組15只)、空白感染白念組(N2組15只)、脾虛模型對(duì)照組(M1組15只)、脾虛感染白念組(M2組15只)。分別令N2和M2組小鼠感染白色念珠菌，白念菌濃度為2×108CFU/ml，劑量為0.2 ml/10 g體質(zhì)量，于染菌后第21天進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)。采用RT－PCR法檢測(cè)各組小鼠小腸組織中穿孔素(Perforin)、顆粒酶(Granzyme)mRNA表達(dá)水平;采用western－blot法檢測(cè)各組小鼠小腸組織中Perforin、Granzyme表達(dá)水平。結(jié)果:各組小鼠小腸組織中Perforin、Granzyme mRNA及蛋白表達(dá)水平檢測(cè)結(jié)果顯示，與N1組比較，N2組、M1組、M2組小鼠小腸組織中Perforin、Granzyme mRNA及蛋白表達(dá)水平顯著升高;與N2組比較，M1組Perforin、Granzyme mRNA及蛋白表達(dá)水平顯著降低，而M2組Perforin、Granzyme mRNA及蛋白表達(dá)水平顯著升高;與M1組比較，M2組Perforin、Granzyme mRNA及蛋白表達(dá)水平顯著升高。結(jié)論:小腸局部黏膜組織中Perforin和Granzyme高表達(dá)水平可能是造成小腸黏膜局部損傷的免疫機(jī)制之一。

脾虛證;白色念珠菌;感染;穿孔素;顆粒酶

白假絲酵母菌(candida Albicans)又稱白色念珠菌，是假絲酵母菌中最常見(jiàn)的致病菌。正常情況下，存在于人的口腔、上呼吸道、腸道及陰道中，數(shù)量極少，一般不引起疾病。當(dāng)機(jī)體免疫功能下降或正常菌群失調(diào)時(shí)，白色念珠菌就會(huì)大量繁殖并改變生長(zhǎng)形式侵入細(xì)胞引起疾病。脾虛證的發(fā)生不僅有先天因素，還與后天的飲食不節(jié)、嗜食肥甘等因素有密切關(guān)系。此外，消耗性疾病的中晚期常伴隨著脾虛證的發(fā)生。

本研究擬通過(guò)觀察脾虛模型小鼠感染白色念珠菌后，小腸黏膜組織中IL－10、12的表達(dá)水平，探討白色念珠菌感染脾虛模型小鼠的部分機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)昆明種小白鼠60只，購(gòu)自遼寧長(zhǎng)生生物科技有限公司(實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(遼)2010－0001)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物購(gòu)入后，飼養(yǎng)于遼寧中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)動(dòng)物室內(nèi)(許可證號(hào)SYXK(遼)2013－0009)。常規(guī)顆粒飼料喂養(yǎng)，自由食水，12 h晝夜節(jié)律。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥品 白色念珠菌菌株(Candida albicans 03382株)由北京大學(xué)第一醫(yī)院皮膚科惠贈(zèng)。豬油脂、甘藍(lán)購(gòu)自樂(lè)購(gòu)超市長(zhǎng)客總站店。Anti－Perforin(ab180773)、Anti－Granzyme B(ab53097)。

1.1.3 儀器設(shè)備 電熱恒溫培養(yǎng)箱(HH·B11 ·500型，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠);凝膠成像分析系統(tǒng)，上海天能科技有限公司，Tanon－4200SF型;梯度PCR儀，美國(guó)ABI公司，VERITI96孔梯度PCR型.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物分組 健康SPF級(jí)昆明種小白鼠60只，按隨機(jī)數(shù)字表法分為空白對(duì)照組(N1組15只)、空白感染白念組(N2組15只)、脾虛模型對(duì)照組(M1組15只)和脾虛感染白念組(M2組15只)。

1.2.2 模型復(fù)制 實(shí)驗(yàn)第1天起，參照文獻(xiàn)［1］將M1、M2組小鼠單日喂飼甘藍(lán)，并強(qiáng)制性游泳至耐力極限;雙日施加豬油0.2 ml/10 g/體質(zhì)量灌胃，并正常進(jìn)食，連續(xù)14 d，N1、N2組小鼠正常飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)14 d后，按照脾虛模型宏觀診斷標(biāo)準(zhǔn)［2］對(duì)模型復(fù)制組小鼠進(jìn)行模型評(píng)價(jià)。

1.2.3 模型評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn) 造模小鼠出現(xiàn)體質(zhì)量下降、便溏或稀便、食少納呆、毛色枯槁、蜷縮聚堆、反應(yīng)遲鈍甚至膽怯狀態(tài)等表現(xiàn)，說(shuō)明脾虛造模成功。

1.2.4 白色念珠菌感染 脾虛模型復(fù)制成功后，對(duì)N2組和M2組小鼠經(jīng)口感染白色念珠菌，白念菌濃度為2×108CFU/ml，劑量為0.2 ml/10 g體質(zhì)量，N1、M1組小鼠給予等量生理鹽水經(jīng)口灌胃，感染后正常飼養(yǎng)21 d。

1.2.5 指標(biāo)檢測(cè) 各組小鼠小腸組織中Perforin、Granzyme mRNA表達(dá)水平檢測(cè):采用RTPCR法檢測(cè)各組小鼠小腸組織中Perforin、Granzyme mRNA的表達(dá)水平。擴(kuò)增引物序列:Granzyme:上游:5’－GACTTTGTGCTGACTGCTGCTCAC－3’;下游:5’－TTGTCCATAGGAGACGATGCCCGC－3’，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度:465 bp。Perforin:上游:5’－TGCTAC ACTGCCACTCGGTCA－3’，下游:5’－GCATGC TCTGTGGAGCTGTTA－3’，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度:566 bp。β－actin:5’－AGCGGGAAATCGTGCGTG－3’，5’－CAGGGTACAT GGTGGTGCC－3’，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度: 288 bp。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，于凝膠成像分析系統(tǒng)中采集電泳圖片，并測(cè)定條帶積分光密度值，以目的基因積分光密度值/內(nèi)參基因積分光密度值比值作為統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。各組小鼠小腸組織中Perforin、Granzyme蛋白表達(dá)水平檢測(cè):采用 western－blot法檢測(cè)各組小鼠小腸組織中Perforin、Granzyme的蛋白表達(dá)水平，凝膠成像分析系統(tǒng)采集圖像，并測(cè)定條帶灰度值，以目的蛋白灰度值/內(nèi)參蛋白灰度值比值作為統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。各組數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠小腸組織中Perforin mRNA及蛋白表達(dá)水平

表1、圖1～2顯示，與N1組比較，N2組、M1組、M2組小鼠小腸組織中Perforin mRNA及蛋白表達(dá)水平顯著升高(P＜0.01);與N2組比較，M1組Perforin mRNA及蛋白表達(dá)水平顯著降低(P＜0.01)，而M2組Perforin mRNA及蛋白表達(dá)水平顯著升高(P＜0.01);與 M1組比較，M2組 Perforin mRNA及蛋白表達(dá)水平顯著升高(P＜0.01)。

表1 各組小鼠小腸組織中Perforin mRNA及蛋白表達(dá)水平(±s)

表1 各組小鼠小腸組織中Perforin mRNA及蛋白表達(dá)水平(±s)

注:與空白對(duì)照組比較:*P＜0.01;與空白感染白念組比較:#P＜0.01;與脾虛模型對(duì)照組比較:△P＜0.01

組別 鼠數(shù)Perforin mRNA Perforin空 白 對(duì) 照 組10 0.136±0.010 0.133±0.013空白感染白念組 10 0.243±0.021* 0.227±0.016*脾虛模型對(duì)照組 10 0.220±0.014*# 0.200±0.020*#脾虛感染白念組 10 0.304±0.035*#△ 0.276±0.027*#△

圖1 各組小鼠小腸組織中Perforin mRNA表達(dá)電泳圖

圖2 各組小鼠小腸組織中Perforin蛋白表達(dá)電泳圖

2.2 各組小鼠小腸組織中Granzyme mRNA及蛋白表達(dá)水平

表2、圖3～4顯示，與N1組比較，N2組、M1組、M2組小鼠小腸組織中Granzyme mRNA及蛋白表達(dá)水平顯著升高(P＜0.01);與N2組比較，M1組Granzyme mRNA及蛋白表達(dá)水平顯著降低(P＜0.01或 0.05);與 M1組比較，M2組 GranzymemRNA及蛋白表達(dá)水平顯著升高(P＜0.01)。

表2 各組小鼠小腸組織中Granzyme mRNA及蛋白表達(dá)水平(±s)

表2 各組小鼠小腸組織中Granzyme mRNA及蛋白表達(dá)水平(±s)

注:與空白對(duì)照組比較:*P＜0.01;與空白感染白念組比較:##P＜0.05，#P＜0.01;與脾虛模型對(duì)照組比較:△P＜0.01

組別 例數(shù)Granzyme mRNA Granzyme空 白 對(duì) 照 組10 0.125±0.007 0.128±0.008空白感染白念組 10 0.220±0.016* 0.223±0.011*脾虛模型對(duì)照組 10 0.198±0.010*# 0.197±0.017*##脾虛感染白念組 10 0.276±0.028*##△ 0.266±0.027*##△

圖3 各組小鼠小腸組織中Granzyme mRNA表達(dá)電泳圖

圖4 各組小鼠小腸組織中Granzyme B蛋白表達(dá)電泳圖

3 討論

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，機(jī)體先天稟賦不足或后天失養(yǎng)時(shí)，脾氣不足以完成運(yùn)化水濕等主要生理功能，機(jī)體即可表現(xiàn)為脾虛證。除先天稟賦不足病因外，脾氣虛多因飲食不節(jié)、勞累過(guò)度、久病耗傷脾氣所致［3］。本研究采用飲食不節(jié)加勞倦過(guò)度的復(fù)合因素制備脾虛小鼠模型，結(jié)果顯示脾虛模型組小鼠出現(xiàn)體質(zhì)量下降、便溏或稀便、食少納呆、毛色枯槁或蜷縮聚堆、反應(yīng)遲鈍、膽怯狀態(tài)等表現(xiàn)，提示脾虛模型復(fù)制成功。

Perforin和Granzyme是在細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用中發(fā)揮其相關(guān)功能的蛋白質(zhì)，主要由細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞(CTL)和NK細(xì)胞釋放，從而產(chǎn)生對(duì)靶細(xì)胞的攻擊作用［4］。Granzyme不能單獨(dú)進(jìn)入靶細(xì)胞內(nèi)，它必須在Perforin的作用下，使靶細(xì)胞形成孔后才能通過(guò)孔進(jìn)入進(jìn)而引發(fā)凋亡［5］。在CTL和NK細(xì)胞的前體細(xì)胞內(nèi)，PFP表達(dá)水平很低，然而在激活后表達(dá)水平則明顯升高［6］。

本研究結(jié)果顯示，Perforin及Granzyme在小腸組織中表達(dá)水平不高。與N1組比較，N2組、M1組、M2組小鼠小腸組織中Perforin、Granzyme mRNA及蛋白的表達(dá)水平均有所上調(diào)，其中在M2組表達(dá)水平上調(diào)最為明顯。提示脾虛感染白念組小鼠小腸組織中Perforin、Granzyme mRNA及蛋白表達(dá)水平升高最為顯著，說(shuō)明脾虛加重了機(jī)體白色念珠菌感染病情，推測(cè)小腸局部黏膜組織中 Perforin和Granzyme高表達(dá)水平可能是造成損傷的發(fā)生免疫機(jī)制之一。

此外據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，Perforin和Granzyme聯(lián)合使用能夠誘發(fā)對(duì)Fas配體抵抗性的癌細(xì)胞凋亡［7］。本研究中Perforin和Granzyme能否誘發(fā)小腸黏膜局部細(xì)胞凋亡，還有待于進(jìn)一步研究。

［1］黃柄山，毛翼楷，范隆昌，等.飲食失節(jié)所致的脾虛動(dòng)物模型及中藥治療觀察［J］.中西醫(yī)結(jié)合雜志，1983，3(5):295－296.

［2］鄒世潔，周永生，樊雅莉，等.脾氣虛證動(dòng)物模型規(guī)范化的初步研究宏觀癥征部分［J］.中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合消化雜志，2001，9(5):264－267.

［3］韓曉偉，馬賢德，侯殿東，等.白念珠菌消化道感染對(duì)脾虛小鼠腸組織中IFN－γ mRNA及IL－10 mRNA表達(dá)的影響［J］.中華中醫(yī)藥雜志，2015，4:1062－1065.

［4］Griffiths GMet al.Immunol Today，1991，12(11):415.

［5］Shi L，Mai S，Israels S，et al. Granzyme B (GraB) autonomously［J］.J Exp Med，1997，185(5):855－66.

［6］Hishii M，Kurnick J T，Ramirez Montagut T，et al.Studies of the mechanism.by tumor infiltrating lymphocytes［J］.Clin Exp Immunol，1999，116(3):388.

［7］Lefai Eet al［J］.Biochem J，2001，360(1):117.

Effect of intestinal infection of Candida albicans on Granzyme and Perforin in small intestine of spleen deficiency mice

MA Xian－de HAN Xiao－weiGUAN Hong－quan△
(Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Shenyang 110032，China)

Objective:To investigate the expression of and Perforin in the small intestine of mice with spleen deficiency and the expression of and Granzyme in the small intestine.Methods:60 healthy SPF mice were randomly divided into two groups:blank group(N group，30 mice);spleen deficiency model group(M group，30 mice).The model of improper diet and overstrain of replication in mice with spleen deficiency syndrome of spleen deficiency model mice.After successful model replication，M and N mice were randomly divided into two groups:control group(N1 group，15 mice);control group(M1，15 mice);spleen deficiency model group(M2，15 mice).N2 and M2 mice were infected with Candida albicans，and the concentration of white fungus was 2×108CFU/ml，and the dose was 0.2 ml/10 g.Twenty－first days after infection，the related indexes were detected.The expression level of Perforin and mRNA was detected by RT－PCR assay，and the expression of and Perforin in the small intestine of mice were detected by Western－blot assay.Granzyme assay was used to detect the expression of and Granzyme.Results:mRNA Perforin and protein expression levels of Perforin，Granzyme Perforin and protein expression levels were compared with the control group.The expression levels of Perforin，mRNA Perforin and protein were significantly increased in mice treated with Granzyme，mRNA and，compared with control group(Granzyme)，Granzyme，mRNA mRNA and protein expression levels were significantly increased in spleen deficiency model group(Granzyme).Conclusion:the high expression of Granzyme and Perforin may be one of the mechanisms of local damage in small intestine mucosa.

spleen deficiency;Candida albicans;infection;perforation;granule enzyme.

R285.5

:B

:1006－3250(2015)12－1519－03

2014－02－24

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81173145);遼寧中醫(yī)藥大學(xué)省部共建中醫(yī)臟象理論及應(yīng)用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

馬賢德(1979－)，在讀博士，從事中醫(yī)藥抗感染免疫的臨床與研究。

△通訊作者:關(guān)洪全(1954－)，博士研究生導(dǎo)師，從事中醫(yī)藥對(duì)虛證調(diào)控的臨床與研究，E－mail:hongquanguan@sina.com。