建立乙醇、HBV雙因素所致肝癌癌前病變小鼠模型的探討?

唐東昕，郭 斌，羅 莉，龍奉璽，王定雪，李 軍，王鏡輝，黃 慧，楊 柱△

(1.中國中醫科學院博士后科研流動站，北京 100700;2.貴陽中醫學院，貴陽 550025; 3.劉尚義國醫大師傳承工作室，貴陽 550001)

建立乙醇、HBV雙因素所致肝癌癌前病變小鼠模型的探討?

唐東昕1，3，郭 斌2，3，羅 莉2，龍奉璽2，王定雪2，李 軍2，王鏡輝2，3，黃 慧2，楊 柱2，3△

(1.中國中醫科學院博士后科研流動站，北京 100700;2.貴陽中醫學院，貴陽 550025; 3.劉尚義國醫大師傳承工作室，貴陽 550001)

目的:建立乙醇、HBV雙因素誘導的肝癌癌前病變小鼠模型。方法:將32只HBV轉基因小鼠，按隨機數字表法分為16周對照組和模型組、22周對照組和模型組四組各8只，通過比較小鼠肝重和肝臟指數變化及肝臟病理變化來評價模型的建立情況。結果:模型組肝重和肝臟指數明顯增加，肝臟形態學變化顯示22周模型組肝損傷最嚴重，肝細胞層次1～3層增加，肝索排列紊亂，肝細胞不典型增生有小細胞性改變，細胞具有異型性。結論:乙醇、HBV雙因素刺激可加重肝損傷，22周時模型組出現肝癌癌前病理變化，肝癌癌前病變動物模型的建立對于進一步探討肝癌癌前病變的發病機制具有重要意義。

乙醇;HBV轉基因小鼠;肝臟指數;肝癌癌前病變;動物模型

近年來，肝癌癌前病變的研究越來越受到重視，其動物模型多采用二乙基亞硝胺(DEN)等化學致癌因素誘發所致，動物模型的合理性決定著后續研究的科學性。根據流行病學提示，飲酒和HBV感染是中國人肝癌發生的兩大重要誘因。基于此，本課題組采用乙醇和HBV雙因素誘發建立肝癌癌前病變小鼠模型，使其接近于國人肝癌發病特點，這對于探索肝癌癌變過程和阻斷機制有著重要的意義。

1 材料

1.1 動物

拷貝高復制HBV轉基因雄性小鼠32只，6～8周齡，體質量(23±2)g，購自中國人民解放軍第四五八醫院全軍肝病中心(動物合格證號SCXK(軍) 2012-0018)。

1.2 試劑

53%(v/v)紅星二鍋頭白酒，產自北京紅星股份有限公司(產品標準號GB/T10781.2);4%多聚甲醛，來自Biotoopped公司。

1.3 儀器

TB-215D型電子天平(美國丹佛公司)，YB-6LF型生物組織石蠟包埋機(湖南亞光公司)，RM2235型組織切片機(德國LEICA公司)，YT-7F型攤烤片機(湖南亞光公司)，BX51型顯微鏡(日本OLYMPUS公司)。

2 方法

2.1 肝癌癌前病變小鼠模型的制備

32只HBV轉基因小鼠適應性飼養1周后，按隨機數字表法分為16周對照組、16周模型組、22周對照組和22周模型組每組各8只。模型組給予53%(v/v)紅星二鍋頭白酒劑量為10 ml·kg-1灌胃，每天1次;對照組小鼠給予等體積蒸餾水灌胃，每天1次。小鼠自由進食、飲水，每5 d稱重1次，根據體質量變化調整灌胃劑量，小鼠分別于第16、22周末取相應組小鼠處死，取肝組織行病理切片，觀察肝臟病理變化。

2.2 小鼠一般情況觀察

實驗過程中觀察小鼠的活動情況、精神狀態、皮毛光澤度、食欲等。

2.3 小鼠肝重和肝臟指數的影響

于造模第16、22周末各組分別稱重后摘除眼球取血，頸椎脫臼處死后立即取小鼠肝臟，鹽水沖洗后吸干水分稱重，計算小鼠肝臟指數。肝臟指數=肝臟質量/小鼠體質量(g)×100［1］。

2.4 肝組織形態學影響

于造模第16、22周末取相應小鼠的肝組織，鹽水沖洗吸干水分后，放入已準備好的4%多聚甲醛固定液瓶中固定、脫水、包埋、切片、HE染色［2］，在400倍光鏡下觀察肝組織病理情況。

2.5 評價標準

根據文獻制定［3-4］:①顯微鏡下可見肝細胞不典型增生(小細胞性改變和/或大細胞性改變);②肉眼可見肝組織出現結節性或局灶性改變。出現①和/或②即可判定為肝癌癌前病變。

2.6 統計學方法

采用SPSS18.0軟件進行統計分析，數據以均數±標準差(±s)表示，組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 小鼠一般狀況

對照組小鼠灌胃后，精神、呼吸、運動均正常，毛發光澤，對刺激反應靈敏，進食飲水正常并隨體質量增加略有增加。模型組小鼠灌胃初期出現精神萎靡、呼吸急促、活動減少、刺激反應減弱、嗜睡、進食飲水減少等情況。從實驗開始第4周起，模型組小鼠灌胃后精神萎靡、呼吸急促、嗜睡現象開始減輕，小鼠體質量略有增加，同時發現模型組小鼠打斗比對照組多，從第12周起開始出現有胃腸脹氣死亡小鼠，同時觀察發現模型組小鼠毛發比空白對照組小鼠毛發稀疏。模型組小鼠從第14周出現眼睛異常明顯現象。

3.2 小鼠肝重和肝臟指數的影響

表1顯示，與16周對照組比較，16周模型組肝重和肝臟指數明顯增加，有統計學意義(P＜0.05);與22周對照組比較，22周模型組肝重和肝臟指數明顯增加，有統計學意義(P＜0.05);與16周模型組比較，22周模型組肝重和肝臟指數明顯增加，有統計學意義(P＜0.05)，提示乙醇、HBV雙因素刺激可加重肝損傷，損傷程度與時間長短成正比。

表1 16周與22周肝重和肝臟指數比較(±s，n=6)

表1 16周與22周肝重和肝臟指數比較(±s，n=6)

注:與對照組比較:△P＜0.05;與16周模型組比較:＊＊P＜0.05

時間/wk 組 別 肝重/g 肝重指數/% 16 對照組1.331±0.026 4.490±0.092模型組 1.457±0.038△ 5.691±0.322△22 對照組 1.370±0.043 4.419±0.140模型組 1.568±0.033△＊＊ 6.236±0.239△＊＊

3.3 肝組織形態學

HE染色400倍光鏡下觀察對照組小鼠肝小葉結構存在，肝細胞索排列基本整齊，肝細胞水腫明顯，細胞大小一致，有輕微的脂肪變性和匯管區，但管周可見少量的炎細胞(見圖2A、2C)。16周模型組小鼠部分區域肝細胞層次1～2層增加，肝索排列紊亂，肝細胞水腫明顯，肝細胞不典型增生有大細胞性改變，細胞具有異型性，肝細胞核和細胞都增大，核/漿比一般保持正常，核多異型性，常見核深染和多核，可見肝細胞點狀壞死，并有部分區域炎性細胞浸潤(見圖2B)。22周模型組部分區域肝細胞層次1～3層增加，肝索排列紊亂，肝細胞不典型增生有小細胞性改變，細胞具有異型性，肝細胞的細胞體積減小，核/漿比增大，輕度核多形性和核深染，并可見小片狀壞死及大量炎細胞浸潤(見圖2D)。

圖2 肝組織病理切片HE染色結果(400×)

3 討論

大多數學者認為，癌前病變的過程是可逆的，而早發現、早診斷、早治療是肝癌防治的關鍵，也是中醫“治未病”思想的體現。肝癌癌前病變動物模型的建立，是開展肝癌癌前病變基礎研究的重要手段，對于進一步探討肝癌癌前病變的發病機制具有重要意義。目前，采用化學致癌因素誘發肝癌癌前病變模型的建立最常見的是二乙基亞硝胺(DEN)、黃曲霉毒素B1(AFB1)、四氯化碳(CCL4)等。以上方法誘導的肝癌癌前病變模型用肉眼即可觀察到肝組織上明顯的結節性變化，筆者認為這種變化更接近癌變而非癌前病變。如何選擇誘發因素建立更為理想的肝癌癌前病變模型是后期實驗研究的關鍵所在。

全球大約有3.5億人是乙肝病毒(HBV)的慢性攜帶者，中國更是HBV感染高發區，約7億人感染過HBV［5］。流行病學研究已經證實，HBV感染與肝細胞癌(HCC)的發展之間存在著密切相關性［6］。世界衛生組織(WHO)指出:“酒精毒性對肝臟的影響最大，對病毒性肝炎、肝癌等的發生、發展及預后都有重要影響。”如果酗酒的同時又并發肝炎病毒感染，其肝癌發生率可高達50%以上。我們應該認識到，至少25%的乙醇性肝病患者同時并發HBV感染及演變為肝癌的高危性［7］。

中醫學無病毒性肝炎及酒精性肝病之類的名稱，但中醫古代文獻對慢性乙型肝炎的臨床表現以及長期大量飲酒造成的危害均有所論述，其內容散見于黃疸、脅痛、積聚、鼓脹以及酒風、酒癖、酒勞、酒傷［8］等疾病的論述中。國醫大師劉尚義指出:病毒性肝炎和酒精性肝病的病變機理各有特點，但2種病邪皆俱濕熱毒性，酒毒傷脾及肝，疫毒損肝犯脾致肝脾同病，氣滯、瘀血、痰濕、水飲等病邪裹結形成癌毒，癌毒聚集于肝日久生變，虛實錯雜，疾病難愈。2種致病因素相互作用，必然加快疾病的進程，可能導致肝癌的發生。因此，課題組在劉尚義對“治未病”思想的指導下，專門針對HBV感染同時飲酒的肝癌高危人群，建立乙醇性HBV轉基因小鼠肝癌癌前病變模型，為肝癌前病變動物模型的建立探索新的方法，為深入研究肝癌發生發展的分子生物學機制奠定基礎。

肝臟的質量變化可以客觀地反映肝臟病變的情況，在酒精性肝損傷時肝細胞會發生腫大，胞質變性，肝細胞微管受損傷，從而導致分泌功能障礙，分泌性蛋白潴留，肝細胞呈氣球樣變，嚴重時肝脂質代謝紊亂，肝細胞內脂肪堆積，肝細胞呈脂肪變性，均可致肝臟腫大、體積增大和質量增加。通過對肝組織病理結果分析發現，對照組HBV轉基因小鼠已經具有明顯的脂肪變性及炎細胞浸潤。國內學者通過酒精對BALB/c小鼠進行16周造模同樣觀察到肝損傷的情況，但是肝癌癌前病變情況不明顯［9］。

本實驗用乙醇、HBV雙因素加大誘導力度，并在16周的基礎上增加22周這個時間點來觀察小鼠肝臟損傷的病理改變。通過病理結果可以看出，16周模型組已出現肝細胞層次增加，肝索排列紊亂，偶見有大細胞出現，細胞具有異型性，肝細胞核和細胞增大，核/漿比一般保持正常，核多異型性，常見核深染和多核，可見肝細胞點狀壞死，并有部分區域見炎性細胞浸潤;22周模型組部分區域肝細胞層次具有1～3層增加，肝細胞不典型增生并有小細胞出現，肝細胞體積減小，核/漿比增大，輕度核多形性和核深染，并可見小片狀壞死及大量炎細胞浸潤。值得注意的是，22周模型組已出現小細胞性改變。

目前對于肝癌癌前病變的界定尚有爭議，沒有公認指標。有研究表明［4，10］，在慢性乙型肝炎中大細胞變顯示為一個腫瘤相關的病變，認為大細胞變至少提示發生了傾向于肝癌發病的慢性損傷，而小細胞不典型增生比大細胞不典型增生更可能是一種癌前病變。小細胞變的生長速度快于正常肝細胞，與肝癌的發生關系密切，屬于癌前病變，而病灶內小細胞性改變主要存在于HBV、HCV慢性感染或酗酒所致的HCC高危慢性肝病中［11-13］。本實驗22周乙醇誘導的HBV轉基因型小鼠模型組可于鏡下見到肝細胞不典型增生，有大細胞性和小細胞性改變，基本符合肝癌前病變模型的判斷標準，由此可以推斷造模成功。

綜上，筆者認為顯微鏡下肝細胞不典型增生(小細胞性改變和/或大細胞性改變)更符合癌前病變的前瞻性，更有利于肝癌的防治。本實驗肉眼未觀察到明顯的結節及局灶性改變，可能與造模周期、灌酒次數、給酒方式等因素相關，需要進一步證實。

［1］王麗，呂紀華，饒偉源，等.保肝片對大鼠肝纖維化模型的影響［J］．中國實驗方劑學雜志，2013(7):234-236.

［2］俞琦，田維毅，楊柱.葛根散等3首解酒方對急性酒精中毒小鼠細胞因子水平的影響［J］.時珍國醫國藥，2011(5):1171-1173.

［3］楊擁軍.肝細胞性肝癌癌前病變形態學特點及分子生物學研究進展［J］．中國腫瘤，2008(1):41-44.

［4］Bosman F T.消化系統腫瘤WHO分類［M］.4版.崔全才，譯.北京:診斷病理學雜社，2012:434-435.

［5］Chinese Society Of Hepatology，Chinese Medical Association Chinese Society of Infectious Diseases.［The guideline of prevention and treatment for chronic hepatitis B(2010 version)［J］．Zhonghua Liu Xing Bing Xue Za Zhi，2011，32(4):405-415.

［6］Tarocchi M S.Polvani，G.Marroncini，A.Galli.Molecular mechanism of hepatitisB virus-induced hepatocarcinogenesis［J］．World J Gastroenterol，2014，20(33):11630-11640.

［7］江正輝，黃志強，董家鴻.亞臨床肝癌［M］.北京:軍事醫學科學出版社，2003:47-50.

［8］楊柱.酒傷病因病機探討——酒傷專題之二［J］.江蘇中醫藥，2002，23(6):32-33.

［9］蘇俊.小鼠酒精性肝纖維化模型的建立及酒精性肝病的臨床分析［D］．第一軍醫大學，2007.

［10］Aaltonen，Stanley R.Hamilton，Lauri A.消化系統腫瘤病理學和遺傳學［M］.虞積耀，崔全才，譯.北京:人民衛生出版社，2006:204.

［11］楊先照.肝癌前病變中醫證候特點及抗纖抑癌方對其HGF和C-Met mRNA調控作用研究［D］.北京:北京中醫藥大學，2012.

［12］何秀蘭，肖俐，劉傳波，等.鱉甲煎化裁與局部微創相結合治療原發性肝癌38例臨床觀察［J］.中國中醫基礎醫學雜志，2013，19(4):470.

［13］方肇勤，梁超，任紅艷.肝癌常用治法復方抑制肝癌細胞惡性增殖的機制研究［J］.中國中醫基礎醫學雜志，2013，19(1): 34.

A study on the mouse model of precancerous lesion of liver cancer caused by the Ethanol and HBV factors based on the idea of the prevention disease

TANG Dong-xin1，3，GUO Bin2，3，LUO Li2，LONG Feng-xi2，WANG Ding-xue2，LI Jun2，WANG Jing-hui2，3，HUANG Hui2，YANG Zhu2，3△
(1．China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing 100700，China;2．Guiyang College of Traditional Chinese Medicine，Guiyang 550025，China;3．National Medical Master Liu Shangyi’s Inheritance studio，Guiyang 550001，China)

Objective:Established mouse model of hepatocellular carcinoma precancerous lesions with ethanol and HBV-induced two-factor，provide a better model for liver cancer and precancerous lesions of basic research and experimental treatment.Methods:32 HBV transgenic mice were randomly divided into 16 weeks control group，16 weeks model group，22 weeks control group and 22 weeks model group(n=8)，by comparing the liver weight and liver index changes and pathological changes in the liver to evaluate the model established case.Results:Compared with the control group，model group liver weight and liver index increased significantly;compared with 16 weeks model group，the 22 weeks model group liver weight and liver index increased significantly.Morphological changes in liver Display:22 weeks in the model group is the most serious of liver injury，liver cells increased levels 1～3，hepatic cord disorder，liver cell dysplasia small cell changes，cells atypia.Conclusion:Ethanol，HBV two-factor stimulation can aggravate liver injury，22 weeks HBV transgenic mice model group has liver performance of precancerous lesions.

Ethanol;HBV transgenic mice;Liver index;Hepatocellular carcinoma precancerous;Animal model

R285.5

:B

:1006-3250(2015)11-1374-03

2015-02-16

國家自然科學基金資助項目(81160417，81460697);貴州省研究生工作站計劃(黔教研合JYSZ字［2014］018);貴州省科學技術廳-貴陽中醫學院科學技術聯合基金項目(黔科合LH字［2014］7336號)

唐東昕(1977-)，男(土家族)，湖南黔陽人，教授，醫學博士，從事中醫藥防治腫瘤的基礎與臨床研究。

△通訊作者:楊 柱(1964-)，男，教授，醫學博士，從事腫瘤病因病機的基礎與臨床研究，Tel:0851-85652079，E-mail: yangzhu20150426@163.com。