丹蛭降糖膠囊對高脂飼養大鼠骨骼肌脂聯素蛋白構成的影響?

陳 燕，陳明衛△，方朝暉，夏同佳，童俊露，王佑民

(1.安徽醫科大學第一附屬醫院內分泌科，合肥 230032; 2.安徽中醫藥大學第一附屬醫院內分泌科，合肥 230031)

丹蛭降糖膠囊對高脂飼養大鼠骨骼肌脂聯素蛋白構成的影響?

陳 燕1，陳明衛1△，方朝暉2，夏同佳1，童俊露1，王佑民1

(1.安徽醫科大學第一附屬醫院內分泌科，合肥 230032; 2.安徽中醫藥大學第一附屬醫院內分泌科，合肥 230031)

目的:觀察丹蛭降糖膠囊對肥胖大鼠骨骼肌脂聯素(APN)蛋白多聚體構成的影響。方法:SD大鼠隨機分為普通對照組(NC組)、高脂對照組(HF組)、低劑量丹蛭降糖膠囊組(FD1組)和高劑量丹蛭降糖膠囊組(FD2組)。檢測血清總APN、高分子量APN(HMW APN)以及骨骼肌組織中各聚合態APN蛋白表達。結果:HF組大鼠血清以及骨骼肌HMW APN均低于NC組，FD1組、FD2組大鼠骨骼肌HMW APN表達高于HF組，FD2組大鼠骨骼肌HMW APN表達顯著高于FD1組。結論:丹蛭降糖膠囊能提高骨骼肌中HMW APN蛋白水平，具有劑量依賴效應。

肥胖;骨骼肌;脂聯素;大鼠;丹蛭降糖膠囊

脂聯素(APN)是脂肪組織分泌性蛋白，與肥胖密切相關［1］。近年來研究表明，APN也可在骨骼肌組織中表達分泌。這種骨骼肌源性APN同樣具有調節糖脂代謝、改善胰島素抵抗(IR)、促進脂肪酸氧化的效應［2-3］。丹蛭降糖膠囊是由太子參、丹皮、生地黃、澤瀉、菟絲子、水蛭組成的復方制劑。研究發現，它可提高肥胖模型大鼠骨骼肌IR，具體機制目前尚不完全清楚［4-5］。本研究通過高脂喂飼建立肥胖大鼠模型，使用丹蛭降糖膠囊進行干預，觀察骨骼肌組織中APN蛋白多聚體構成的變化，初步探討丹蛭降糖膠囊改善骨骼肌IR的機制。

1 材料與方法

1.1 飼養及分組

清潔級4周齡70只雄性SD大鼠，體質量(150 ±30)g，購自安立實驗動物公司(動物合格證號4322)。適應性喂養1周后，隨機挑選15只大鼠作為普通飲食對照組(NC組)，給予普通飼料喂養，其余55只給予高脂飼料喂養，作為高脂飲食組(HD組)。12周后以HD組大鼠體質量超過NC組大鼠平均體質量20%為標準來確定肥胖大鼠造模成功。45只符合肥胖模型的大鼠按體質量再隨機分為高脂對照組(HF組)、高脂+低劑量丹蛭降糖膠囊組(FD1組)、高脂+高劑量丹蛭降糖膠囊組(FD2組)各15只，繼續高脂飲食，同時每組分別給予溶媒2 ml ·kg-1·d-1、丹蛭降糖膠囊470 mg·kg-1·d-1、丹蛭降糖膠囊940 mg·kg-1·d-1灌胃。NC組繼續普通飼料喂養，給予蒸餾水灌胃，持續治療時間4周。

1.2 主要儀器和試劑

MODULE P800型全自動生化分析儀(瑞士羅氏公司)、水平電泳槽、兔抗鼠APN單克隆一抗(美國Millipore公司，克隆號為AD1773，Uniprot編號為Q15848，Entrez基因編號為NM_004797.2)、山羊抗兔多克隆二抗(江蘇碧云天生物科技公司，批號A0562)、蛋白提取試劑盒(上海申能博彩生物技術公司)、BCA蛋白定量試劑盒(江蘇碧云天生物技術公司)、PDVF膜(蘇州廣惠科技有限公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 標本收集 16周時4組大鼠禁食過夜8h后，以10%水合氯醛麻醉，麻醉狀態下準確稱取體質量，下腔靜脈取血分離血清，-80℃冰箱中以備各項生化指標的測定;迅速分離大鼠股四頭肌組織，置于液氮罐中保存以備提取TG。

1.3.2 血液生化指標檢測 強生穩步倍加型血糖儀及配套試紙檢測空腹血糖(FBG)，全自動生化分析儀檢測甘油三酯(TG)、膽固醇(TC)，放射免疫法檢測空腹血清胰島素(FINS，美國Linco公司)，銅顯色法測定血游離脂肪酸(FFA，江蘇南京建成生物公司)。

1.3.3 大鼠血清APN測定 4組大鼠禁食過夜8 h后，以10%水合氯醛麻醉下腔靜脈取血、分離血清。采用大鼠血清APN雙抗體夾心法ELISA試劑盒(美國R＆D公司)測定血總APN、高分子量脂聯素(HMW APN)以及低分子量脂聯素(LMW APN)。主要步驟:設置標準品孔和樣本孔，其中標準品孔加入標準品50 μl，樣本孔加待測樣本10 μl，再加入稀釋液40 μl。隨后標準品孔中和樣本孔中每孔加入辣根過氧化酶標記的檢測抗體100 μl，用封板膜封住反應孔，恒溫箱溫育60 min后應用洗板機洗板干燥。每孔加入底物A、B各50 μl，37℃避光孵育15 min，每孔加入終止液50 μl，15 min內在450 nm波長處測定各孔的OD值。繪制標準曲線，按曲線方程計算各樣本總APN、HMW APN以及LMW APN濃度值(μg/ml)。并根據ELISA法測得結果計算血清中HMW比例=血HMW APN(μg/ ml)/血總APN(μg/ml)。

1.3.4 大鼠骨骼肌組織APN蛋白測定 取100 mg股四頭肌組織剪碎，加入1 ml組織裂解液置于冰上，玻璃勻漿器勻漿，4℃ 12000 rpm×10 min離心，按BCA法測定蛋白濃度。取骨骼肌組織蛋白與非還原非變性加樣緩沖液(江蘇碧云天生物科技公司)混勻于4℃進行8%SDS-PAGE凝膠電泳、轉膜、封閉。加入兔抗鼠APN一抗(1∶300)孵育過夜。第2天加入山羊抗兔IgG抗體-HRP多聚體(二抗試劑，1∶5000)孵育2 h，ECL顯影，使用Band Scan 5.0軟件分析條帶灰度，骨骼肌中各聚合態APN蛋白表達水平以各聚合態APN/GAPDH灰度值表示。骨骼肌中HMW比例=HMW/(HMW+LMW)。

1.4 統計學方法

采用SPSS 13.0軟件進行t檢驗，數據以均數±標準差(±s)表示，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 體質量、代謝指標變化

表1顯示，HF組的體質量、FBG、FINS、TG、TC、FFA均高于NC組(P＜0.05～0.01)。FD1組、FD2組體質量、FBG、FINS、TG、TC、FFA均較HF組有所降低，但差異無統計學意義(P＞0.05)。

2.2 各組大鼠血清總APN、HMW APN、LMW APN水平以及HMW比例的比較

表2顯示，與NC組比較，HF組大鼠血清總APN、HMW APN水平以及HMW比例均明顯降低(P＜0.05);HF組、FD1組、FD2組3組間大鼠血清總APN、HMW APN水平以及HMW比例均無顯著變化(P＞0.05)，4組間LMW APN水平比較差異無統計學意義(P＞0.05)。

表1 各組大鼠體質量、代謝指標的比較(±s)

表1 各組大鼠體質量、代謝指標的比較(±s)

注:與NC組比較:*P＜0.05，＊＊P＜0.01

組 別 鼠數 體質量(g) FBG(mmol/L) FINS(mIU/L) TG(mmol/L) TC(mmol/L) FFA(μmol/L) NC組 15 353.36±42.26 5.11±0.87 11.96±4.16 0.47±0.74 1.43±0.31 327.24±38.31 HF組 15 460.48±53.58＊＊ 6.75±1.99＊＊ 35.12±12.27＊＊ 0.98±0.62＊＊ 1.88±0.34* 475.42±40.18＊＊FD1組 15 457.22±48.91 6.52±1.66 27.96±11.08 0.93±0.69 1.79±0.31 457.83±40.28 FD2組 15 450.13±49.31 6.37±1.71 25.17±10.04 0.90±0.68 1.76±0.32 447.65±43.82

圖1 Western blot檢測大鼠骨骼肌APN多聚體構成

2.3 各組大鼠骨骼肌組織HMW APN、LMW APN水平以及HMW比例的比較

表3顯示，非還原非加熱變性的SDS-PAGE檢測到3條APN蛋白條帶，～130 kDa條帶代表相對低分子量六聚體LMW APN，～250 kDa和＞300 kDa條帶代表高分子量高聚體HMW APN(圖1)。與NC組比較，HF組大鼠骨骼肌HMW APN表達以及HMW比例均明顯降低(P＜0.05～0.01);與HF組比較，FD1組、FD2組大鼠骨骼肌HMW APN表達以及HMW比例均顯著增加(P＜0.05);與FD1組比較，FD2組大鼠骨骼肌HMW APN表達以及HMW比例均顯著增加(P＜0.05)，4組間LMW APN水平比較差異無統計學意義(P＞0.05)。

表2 各組大鼠血清APN水平的比較(±s)

表2 各組大鼠血清APN水平的比較(±s)

注:與NC組比較:*P＜0.05

組 別 鼠數 總APN (μg/ml) HMW APN (μg/ml) LMW APN (μg/ml) HMW/總APN NC組15 4.01±0.13 2.03±0.15 0.73±0.12 0.50±0.06 HF組 15 1.98±0.14* 0.88±0.16* 0.75±0.10 0.44±0.05*FD1組 15 2.15±0.14 1.06±0.18 0.73±0.11 0.46±0.07 FD2組15 2.18±0.15 1.12±0.18 0.73±0.13 0.48±0.06

表3 各組大鼠骨骼肌組織APN蛋白表達比較(±s)

表3 各組大鼠骨骼肌組織APN蛋白表達比較(±s)

注:與NC組比較:*P＜0.05，＊＊P＜0.01;與 HF組比較:△P＜0.05;與FD1組比較:☆P＜0.05

APN 組 別 鼠數 HMW APN LMW APN HMW/總NC組15 1.19±0.14 0.69±0.12 0.69±0.06 HF組 15 0.66±0.15＊＊ 0.62±0.11 0.45±0.05*FD1組 15 0.89±0.14△ 0.63±0.12 0.54±0.06△FD2組 15 1.03±0.13△☆ 0.64±0.13 0.63±0.07△☆

3 討論

目前已證實，APN具有減輕IR、抗動脈粥樣硬化和抗炎作用，其部分生物活性依賴于其自身的多聚體化過程。APN可以通過3個球形結構域將單體連接成三聚體，2～6個三聚體通過膠原結構域進一步連接成LMW APN或者HMW APN的高級結構。血漿中APN以多種聚合態存在，主要為低聚態和高聚態。研究表明，HMW APN是APN作用的主要活性形式，對改善胰島素敏感性更重要。有研究發現，基因部分位點突變會影響APN合成分泌多聚化過程，從而影響HMW APN含量及其比例，導致APN生物活性受損［6］。

高脂誘導的SD肥胖大鼠與人類肥胖的發生過程和表現非常相似，是較理想的營養性肥胖研究模型。本研究發現，與普通飲食組大鼠比較，高脂對照組肥胖大鼠的內臟脂肪明顯增加，糖脂代謝紊亂更加明顯，IR程度加重，同時血清總APN、HMW APN、HMW比例均有一定程度下降，整體上呈抑制狀態，與先前的研究發現一致［7-8］。有研究已證實，高脂高熱卡誘導的肥胖可對皮下以及內臟脂肪組織中APN多聚化過程造成影響［6］，但是否會影響骨骼肌中APN多聚化過程尚不清楚。本研究發現，與普通飲食對照組大鼠比較，高脂對照組大鼠骨骼肌中HMW APN表達以及HMW比例均顯著降低，表明高脂誘導的肥胖可對骨骼肌組織中APN多聚化過程造成影響，從而參與骨骼肌IR的發生發展。

丹蛭降糖膠囊是由太子參、丹皮、生地黃、澤瀉、菟絲子、水蛭組成的復方制劑，已于2006年獲得國家發明專利授權［9］。研究表明，它具有改善糖脂代謝以及IR等功效［4，10］，但其具體機制尚不明確。有研究報道，丹蛭降糖膠囊對2型糖尿病IR大鼠血漿APN水平的改變具有劑量依賴效應，丹蛭降糖膠囊高劑量組較低劑量組升高血漿APN水平更高［11］。故本研究選擇高、低劑量組的丹蛭降糖膠囊進行干預。結果發現，無論低劑量組(FD1組)還是高劑量組(FD2組)，應用丹蛭降糖膠囊干預后，肥胖大鼠血總APN及HMW比例無顯著影響，與先前在2型糖尿病肥胖大鼠中的發現不一致［11］，原因尚不清楚，推測可能與2組研究中實驗大鼠肥胖程度、糖脂代謝紊亂程度等因素差異有關。另一方面，本研究發現，無論是FD1組還是 FD2組，大鼠骨骼肌中HMW APN與HMW比例均有顯著提高，表明在肥胖大鼠骨骼肌中HMW APN的合成分泌水平會受丹蛭降糖膠囊影響而上調，提示丹蛭降糖膠囊可能通過影響肥胖大鼠骨骼肌中APN多聚化過程，從而改善骨骼肌IR。進一步分析還發現，高劑量組中大鼠骨骼肌中HMW APN表達以及HMW比例的提高均顯著高于低劑量組，表明丹蛭降糖膠囊對肥胖大鼠骨骼肌APN多聚化的改變具有劑量依賴效應。本研究結果將為揭示丹蛭降糖膠囊改善骨骼肌IR提供一個新的機制認識。

總之，本研究發現丹蛭降糖膠囊可促進肥胖大鼠骨骼肌中HMW APN的合成分泌，提高HMW比例，這種效應具有劑量依賴效應。

［1］Okamoto Y，Kihara S，Funahashi T，et al.Adiponectin:a key Adipocytokine in metabolic syndrome［J］.Clin Sci(Lond)，2006，110(3):267-278.

［2］Liu Y，Chewchuk，Lavigne C，et al.Functional significance of skeletal muscle adiponectin production，changes in animal models of obesity and diabetes，and regulation by rosiglitazone treatment［J］.Am J Physiol Endocrinol Metab，2009，297(3): E657-E664.

［3］戴堯，陳明衛，方朝暉，等.吡格列酮對胰島素抵抗模型L6細胞脂聯素和GLUT4表達的影響及其機制研究［J］.中華內分泌代謝雜志，2013，29(9):79-81.

［4］方朝暉，鮑陶陶，王開成，等.丹蛭降糖膠囊對糖尿病胰島素抵抗大鼠骨骼肌葡萄糖轉運體IV基因表達的影響［J］.中國實驗方劑學雜志，2006，12(6):32-35.

［5］陳明衛，夏同佳，方朝暉，等.丹蛭降糖膠囊改善高脂飲食誘導的肥胖大鼠骨骼肌胰島素抵抗機制的初步研究［J/CD］.中華臨床醫師雜志:電子版，2014，8(9):1697-1702.

［6］Basu R，Pajvam UB，Rizza RA，et al.Selective downregulation of the high molecular weight form of adiponectin in hyperinsulinemia and in type 2 diabetes:differential regulation from nondiabetic subjects［J］.Diabetes，2007，56(8):2174-2177.

［7］周曉惠，王佑民，王文平，等.非諾貝特對高脂飼養大鼠脂聯素蛋白構成的影響［J］.中國糖尿病雜志，2010，18(3):217-219.

［8］Chen M，Deng D，Fang Z，et al.Fenofibrate increases serum vaspin by upregulating its expression in adipose tissue［J］. Endocrine，2014，45(5):409-421.

［9］方朝暉.丹蛭降糖膠囊及其制備方法:中國，200310112845.1［P］.2006-07-19.

［10］方朝暉，王佑民，王開成，等.丹蛭降糖膠囊對胰島素抵抗大鼠PPAR-γ mRNA表達的影響［J］.中國實驗方劑學雜志，2006，12(4):36-39.

［11］方朝暉，張靜波，王開成，等.丹蛭降糖膠囊對2型糖尿病胰島素抵抗大鼠脂聯素的影響［J］.中醫藥臨床雜志，2008，20 (6):613-615.

Effects of Danzhi Jiangtang Capsule on Adiponectin Composition in Skeletal Muscle in Obese Rats Fed with High-fat Diet

CHEN Yan1，CHEN Ming-wei1△，FANG Zhao-hui2，XIA Tong-jia1，TONG Jun-lu1，WANG You-min1
(1．Department of Endocrinology，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230032，China; 2．Department of Endocrinology，The First Affiliated Hospital of Anhui University of TCM，Hefei 230031，China)

Objective:To investigate the effect of Danzhi Jiangtang Capsule on adiponectin compostion in skeletal muscle in high-fat diet(HFD)SD rats.Methods:Rats were randomly divided into 4 groups(n=15):chow diet rats as NC group，HFD rats treated with vehicle，low-dose Danzhi Jiangtang Capsule(470 mg·kg-1·d-1)and high-dose Danzhi Jiangtang Capsule(940 mg·kg-1·d-1)as HF，FD1 group and FD2 group，respectively.Serum total adiponectin and high molecular weight adiponectin were detected by ELISA，respectively.Adiponectin oligomer compostion in skeletal muscle were separated by Western blot under non-heat-denatured and non-reduced conditions.Results:In HF group，either in serum or in skeletal muscle，high molecular weight adiponectin，and the ratio of high molecular weight adiponectin to total adiponectin were all significantly reduced as compared with NC group.Compared with HF group，both low-dose Danzhi Jiangtang Capsule and high-dose Danzhi Jiangtang Capsule showed a significant increase of high molecular weight adiponectin，and the ratio of high molecular weight adiponectin to total adiponectin in skeletal muscle.Moreover，high molecular weight adiponectin expression，and the ratio of high molecular weight adiponectin to total adiponectin in skeletal muscle in FD2 group were significantly higher than those in FD1 group.Conclusions:Danzhi Jiangtang Capsule could enhance high molecular weight adiponectin level in skeletal muscle in a dose-independent manner.

Obese;Skeletal muscle;Adiponectin;Rats;Danzhi Jiangtang

R285.5

:B

:1006-3250(2015)11-1447-03

2015-04-07

國家中醫臨床研究基地專項課題(JDZX2012005)-肌源性脂聯素在高脂誘導的骨骼肌胰島素抵抗中的作用以及丹蛭降糖膠囊的干預研究

陳 燕(1987-)，女，安徽蕪湖人，主治醫師，在讀碩士，從事肥胖發病機制的臨床與研究。

△通訊作者:陳明衛(1968-)，男，安徽肥東人，主任醫師，從事肥胖發病機制的臨床與研究，Tel:0551-62922069。