濕溫病“內外相引”的機理研究?

舒發明，劉業方，黃 英，馮全生，鄭秀麗

(成都中醫藥大學，成都 610075)

濕溫病“內外相引”的機理研究?

舒發明，劉業方，黃 英，馮全生，鄭秀麗△

(成都中醫藥大學，成都 610075)

目的:觀察外濕(濕邪)對正常大鼠和脾虛造模大鼠胃腸功能影響的規律及其機制，從分子生物學角度揭示濕邪作用機體產生損傷的機理，探討濕溫病“內外相引”的機理。方法:將40只大鼠按隨機數字表法分成空白對照組、外濕組、內濕組、內外兼濕組4組各10只。采用ELISA法檢測各組大鼠胃竇生長抑素(SS)、P物質(SP)、血清中胃動素(MTL)及胃泌素(GAS)的變化，HE染色觀察胃腸組織病理改變。結果:外濕組、內濕組大鼠胃竇SS、SP、MTL及GAS含量均較空白對照組降低，內外兼濕組顯著降低。病理結果顯示，外濕組、內濕組、內外兼濕組胃組織均存有不同程度的充血、炎癥、糜爛，小腸組織亦發現充血、炎癥，內外兼濕組可見輕度糜爛，且小腸組織病理形態改變較胃組織輕。結論:外濕組、內濕組、內外兼濕組均存在大鼠胃腸激素、胃腸病理組織改變，表明濕與脾胃關系密切，而內外兼濕組改變最明顯，客觀表明“內外相引”為濕溫病的重要病機。

濕溫;內外相引;生長抑素(SS);胃竇P物質(SP);胃動素(MTL);胃泌素(GAS)

溫病學認為，濕溫病的發病是由于外濕引動內濕而成，外邪入里，里濕為合，內因脾胃不能運化水谷之濕，外因感受時令之濕導致“太陰內傷，濕飲停聚，客邪再至，內外相引，故病濕熱”。因此，本課題擬以外濕對脾虛大鼠胃腸功能的影響為切入點進行濕溫病“內外相引”的機制研究，觀察外濕(濕邪)對正常大鼠和脾虛造模大鼠胃腸功能影響的規律及其機制，從分子生物學角度揭示濕邪作用機體產生損傷的機理，探討濕溫病“內外相引”的機理。

1 材料

1.1 實驗動物

選用健康 SD大鼠40只，雌雄各半，體質量(200±20)g，由成都中醫藥大學動物實驗中心提供(動物合格證號scxk-09-2006)。

1.2 主要試劑與儀器

SP、SS、MTL、GAS放免試劑盒(北京博奧森生物技術有限公司)，電子秤(ACS-3H，中山市金利電子衡器有限公司制造)、AvantiTM30型冷凍離心機(BECKMAN)、光學顯微鏡(Olympus BX43日本)和Mias2001圖像分析系統等。

2 方法

2.1 分組

將40只大鼠按隨機數字表法分為空白對照組、外濕組、內濕組、內外兼濕組4組，每組各10只。

2.2 造模

參照文獻方法進行［1］。外濕組每天定時放入水深25 cm、水溫27℃～29℃的水桶中游泳15 min。平時使用加濕器霧化加濕持續7 d，復制外濕模型。內濕組按25 ml/kg劑量在第1、3、5、7天行液態豬油灌胃，第2、4、6天行30%蜂蜜灌胃持續7 d，復制脾虛內濕模型。內外兼濕組每天定時放入水深25 cm、水溫27℃ ～29℃的水桶中游泳15 min，游泳完畢后，立即按25 ml/kg劑量在第1、3、5、7天行液態豬油灌胃，第2、4、6天行30%蜂蜜灌胃持續7 d，復制脾虛兼外濕模型。空白對照組不采取任何措施。

2.3 觀測指標及檢測方法

2.3.1 一般情況觀察 每日觀察精神、活動、二便、體質量等，定時記錄飲食量。

2.3.2 胃和小腸組織病理形態觀察 造模后第8天處死動物，取胃和小腸置10%甲醛水溶液中固定，各級濃度脫水、常規石蠟切片、HE染色，光鏡下觀察形態學改變。

2.3.3 血清MTL、GAS水平測定 ELISA法檢測血清胃動素(MTL)和胃泌素(GAS)水平。大鼠腹腔麻醉后，腹主動脈取血，3000 r/min離心10 min，分離血清保存在-20℃ 冰箱中，具體檢測按MTL、GAS酶聯免疫分析試劑盒說明書進行。

2.3.4 胃竇SS、SP水平測定 胃竇組織勻漿后，ELISA法檢測胃竇P物質(SP)和生長抑素(SS)水平。剪取適量胃竇組織稱重，按胃竇組織體積與生理鹽水體積比1∶5比例，盡快加入生理鹽水于勻漿器中碾磨制成勻漿，4℃ 3000 r/min離心15 min，取上清-20℃ 保存備測，具體檢測方法按SP、SS酶聯免疫分析試劑盒說明書進行。

2.4 統計學方法

采用SPSS13.0統計軟件進行統計分析，數據以均數±標準差(±s)表示，各組實驗結果差異性檢驗滿足正態性分布采用方差分析，組間兩兩比較方差齊用LSD法檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 模型一般體征的觀察結果

造模后，外濕組、內濕組和內外兼濕組大鼠均出現活動明顯減少、精神較差、食欲不振、飲食量減少、大便溏、皮毛色澤晦暗發黃、消瘦、腹脹、體質量減輕等癥狀，脾虛兼外濕組變化最為明顯。

3.2 SS、SP、MTL、GAS含量測定結果

表1顯示，與空白對照組比較，外濕組大鼠的SS、SP、MTL、GAS含量均有降低，但差異無統計學意義(P＞0.05)，內濕組大鼠的SS、SP、MTL、GAS含量顯著降低(P＜0.05)，內外兼濕組以上指標含量降低極為顯著(P＜0.01)。與外濕組比較，內濕組大鼠的SS、SP、MTL、GAS含量均顯著降低(P＜0.05)，內外兼濕組以上指標降低極顯著(P＜0.01)。與內濕組比較，內外兼濕組大鼠的SS、SP、MTL、GAS降低更為顯著(P＜0.05)。

表1 各組大鼠SS、SP、MTL、GAS比較(ng/mL，±s)

表1 各組大鼠SS、SP、MTL、GAS比較(ng/mL，±s)

注:與空白對照組比較:△P＜0.05，△△P＜0.01;與外濕組比較:*P＜0.05，＊＊P＜0.01;與內濕組比較:▲P＜0.05

組別 鼠數GAS SS SP MTL空 白 對 照 組10 0.31±0.23 0.43±0.520 0.39±0.44 0.61±0.21外 濕 組 10 0.25±0.52 0.22±0.080 0.22±0.06 0.43±0.15內 濕 組 10 0.14±0.04△＊ 0.17±0.054△＊ 0.13±0.03△＊ 0.39±0.18△＊內 外 兼 濕 組 10 0.08±0.30△△＊＊▲ 0.08±0.290△△＊＊▲ 0.09±0.03△△＊＊▲ 0.25±0.17△△＊＊▲

3.3 胃腸組織病理觀察

圖1、2顯示，對外濕、內濕和內外兼濕3種模型組大鼠解剖發現，多數動物胃腸脹氣明顯，胃內殘留食糜較多。HE染色后，普通光學顯微鏡下觀察，空白對照組胃腸組織均無明顯改變，外濕、內濕和內外兼濕3種模型組動物胃組織黏膜有不同程度黏膜充血、炎癥細胞(淋巴細胞、漿細胞、巨噬細胞)浸潤、黏膜灶性糜爛，部分腺體排列欠規則，黏膜腺體破壞，一些細胞呈散在分布處于增生狀態(漿多、核大、染色質稀疏)，可見點狀、條索狀纖維增生，以上胃組織病理變化嚴重程度按外濕組、脾虛組、內外兼濕組的次序而遞增;小腸組織病理形態與胃組織相似，但其充血、炎癥程度較胃組織輕，且只有內外兼濕組出現有輕度糜爛，外濕、內濕組均未見糜爛。

4 討論

中醫認為，脾主運化水濕為陰土，喜燥惡濕，對濕邪有特殊的易感性，所以脾具有運濕而惡濕的特性。濕為長夏主氣，脾為濕土之臟，濕為土之氣，同氣相從，故濕與脾土相應易阻滯氣機、困阻脾胃，導致脾失健運，出現胃腸消化功能的受損。溫病學家薛生白《濕熱病》指出，濕溫病的發病為“太陰內傷，濕飲停聚，客邪再至，內外相引，故病濕熱”，即外濕引動內濕，以內濕為基礎。

中醫脾胃主運化的功能包含現代醫學胃腸消化吸收的生理過程，消化道的運動除受神經調節外，還受胃腸激素的調節。胃腸激素是一類由胃腸道黏膜層及胰腺內的內分細胞和旁分泌細胞分泌、由胃腸壁的神經末梢所釋放的一組小分子高效能生物活性物質［2］，在胃腸運動調節機制中發揮著重要作用。胃腸激素當中P物質是主要的興奮性神經遞質，其能直接作用于環形肌、縱行肌引起收縮，進而促進胃腸蠕動。現代研究表明，P物質調節胃腸蠕動可能是通過其參與消化間期移行性復合運動來實現的［3］。生長抑素有多種分子形式，它幾乎對所有的生理性內外分泌反應均有抑制作用［4］，可抑制胃泌素、腸的蠕動等各種胃腸激素的分泌等，故對胃腸黏膜的損傷具有保護作用［5］。胃動素(MTL)則具有強烈刺激上消化道的機械運動和生理性肌電活動的作用，是啟動移行性復合運動Ⅲ相的重要啟動因子之一［6］，它的主要生理功能為刺激胃和腸的運動及促進胃蛋白酶分泌，參與消化道運動的調節。胃泌素(GAS)則具有刺激胃蛋白酶、胃酸的分泌，使幽門括約肌和胃竇收縮、幫助消化、延緩胃排空等作用［7］。

本實驗中，外濕組、內濕組、內外兼濕組大鼠胃腸激素、胃腸病理組織均改變，表明濕邪易傷脾胃，濕邪與脾胃關系密切，外濕組、內濕組、內外兼濕組大鼠胃竇的SP含量降低，導致其不能發揮對胃腸道的興奮性刺激作用，外濕組、內濕組、內外兼濕組大鼠可能存在胃腸動力不足，這與濕邪困脾所表現的胃脘痞滿、納差嘔吐、大便稀溏等臨床癥狀一致。同時外濕組、內濕組、內外兼濕組3種模型組SS的含量也降低，這表明SS對消化系統的抑制作用減弱，其對胃酸、胃蛋白酶等分泌抑制作用解除、胃腸道的保護屏障可能受到破壞。本實驗中外濕組、內濕組、內外兼濕組3種模型組MTL、GAS降低，這可能是濕邪釋放各種免疫因子使迷走神經興奮和抑制失調，使MTL和GAS分泌異常。也或因濕邪導致炎癥、缺血使胃腸道瘀血、胃腸黏膜細胞分泌MTL失常，而胃擴張減緩、胃竇部壓力減輕，可使GAS釋放減少。在與空白對照組比較中，脾虛和脾虛兼外濕組變化更為明顯，表明濕邪涉及到臟器病變，進而使MTL及GAS代謝水平異常。脾虛兼外濕組SP、SS、MTL以及GAS的含量較外濕組和內濕組降低更為明顯，亦說明內外兼濕胃動力受抑制程度、胃腸道保護屏障的破壞程度更嚴重，從客觀上體現了葉天士提出的“外邪入里，里濕為合”、外濕引動內濕的理論，也與薛生白提到的“太陰內傷，濕飲停聚，客邪再至，內外相引”的原理相符，為濕溫病“內外相引”的發病特點提供了一定的實驗依據，但濕溫病“內外相引”的相關調控通路尚待進一步的深入研究。

圖1 各組大鼠胃組織切片HE染色結果(HE×200)

圖2 各組大鼠小腸組織切片HE染色結果(HE×200)

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Mechanism research of Dampness warm diseases"internal and external leading"

SHU Fa-ming，LIU Ye-fang，HUANG-Ying，FENG Quan-Sheng，ZHENG Xiu-li△
(Chengdu University of Chinese Medicine，Sichuan Chengdu 610075，China)

Objective:To observe the influence of dampness pathogen on gastrointestinal function of normal rats and spleen deficiency rats and investigate the changing rule of gastrointestinal hormones，to approach the mechanism of damage of body from molecular perspective and to investigate internally and externally interattraction.Methods:A total of 40 rats were divided into 4 groups(each group 10 rats)randomly:the normal control group、the internal wet group、the external wet group、the internal and external wet group.The contents of SS、SP、MTT and GAS in sinus ventriculi were detected by radioimmunoassay，gastrointestinal pathologic changes were observed by HE staining.Results:The contents of SS、SP、MTT and GAS in the internal wet group、the external wet group、the internal and external wet group were obviously lower than those in the normal control group，with the contents of SS、SP、MTT and GAS in internal and external wet group decreased more.Pathology showed:Gastric tissue models(in the internal wet group、the external wet group、the internal and external wet group)have different levels of congestion、inflammation、erosion，intestinal tissues of model group also found that congestion，inflammation，internal and external interattraction showed mild erosion，and the pathological changes of the latter is lighter than the former.Conclusions:There is the certain disorder of gastrointestinal hormones in sinus ventriculi of rats with internal，external wet and Internal and external wet syndromes，pathological changes were generated from stomach and testine tissue.Wet is related to spleen and stomach.Internal and external interattraction is the important pathogenesis of damp warm diseases.

Damp-warm disease;Internally and externally interattraction;SS;SP;Motilin;Gastrin

R285.5

:B

:1006-3250(2015)11-1377-03

2015-04-24

成都中醫藥大學校基金項目-濕溫“內外相引”的機理研究(ZRYB201023)

舒發明(1988-)，男(瑤族)，廣西桂林人，醫學碩士，從事溫病學的臨床與研究。

△通訊作者:鄭秀麗，女，講師，從事溫病學的臨床與研究，Tel:13880937093，E-mail:43726134@qq.com。