不同灌注速度及方法對大鼠膀胱容量、壓力及神經傳入電活動測定的影響*

賴煥玲，梁志健，吳清和，黃萍，操紅纓

(廣州中醫藥大學，廣東 廣州 510006)

·實驗技術·

不同灌注速度及方法對大鼠膀胱容量、壓力及神經傳入電活動測定的影響*

賴煥玲，梁志健，吳清和，黃萍，操紅纓△

(廣州中醫藥大學，廣東 廣州 510006)

目的:探討不同灌注速度及方法對大鼠膀胱容量、壓力及神經傳入電活動測定的影響。方法:SD雌性大鼠隨機分為2組，分別選用尿道插管法及膀胱頂造瘺法，以50、100、200和400 μL/min的速度進行灌注，以尿動力儀觀察灌注過程中膀胱容量及壓力的變化，以多通道生理記錄儀檢測灌注過程中膀胱神經傳入電活動的變化。結果:采用插管法進行灌注測得最大放電頻率，其隨速度的升高呈上升趨勢;膀胱漏尿點壓(BLPP)和最大膀胱排尿壓(MVP)隨著灌注速度的升高而增大;各灌注速度下膀胱最大容量(MBC)無顯著變化。造瘺法以各速度測得最大放電頻率均無顯著變化;其MBC隨速度升高呈下降趨勢，且在200及400 μL/min灌注時顯著降低;其BLPP及MVP無明顯變化。2種方法相比，放電頻率基線值無顯著差異，以100、200和400 μL/min進行灌注時造瘺法測得的膀胱最大放電頻率均低于插管法;以不同速度灌注，造瘺法測得的MBC均比插管法小;而以50和100 μL/min進行灌注時，造瘺法測得的壓力比插管法高。結論:插管法以不同速度進行灌注并未對膀胱容量造成明顯變化，但其膀胱壓力及神經放電頻率隨速度升高，使用此法應根據研究目的選擇灌注速度;采用造瘺法在200及400 μL/ min的灌注速度時，膀胱容量明顯減少，故采用該法時建議以＜200 μL/min的速度進行灌注。

灌注速度;尿道插管術;膀胱頂造瘺;膀胱容量;膀胱壓力

膀胱的主要生理功能是儲尿與排尿。正常的膀胱感覺功能是實現膀胱儲尿和排尿生理過程的基礎，且該過程有賴于神經系統、膀胱逼尿肌和尿道括約的協調。膀胱感覺功能實際上是大腦皮層對來自下尿路傳入神經沖動的主觀感知和整合［1］，主要對下尿路牽張所引起的膨脹、溫度、痛覺和傷害性刺激產生主觀感知。排尿欲是非自主控尿轉向自主控尿的標志。膀胱的機械敏感性所表現出的靜態和動態的變化以及在絕對水平上對刺激和尿液形成的反應依賴于逼尿肌在低速膨脹過程中的適應性變化。膀胱膨脹(充盈)速度可以嚴重影響膀胱測壓的測定結果［2］。國際尿控協會規定，人體采用慢速充盈既速度低于10 mL/min作為生理性充盈。Shea等［3］的研究曾采用生理鹽水以100 μL/min的速度模擬生理性充盈進行大鼠膀胱灌注。膀胱內灌注藥物［4］已經是一種治療膀胱相關疾病的手段，適宜的灌注速度及灌注方法不僅能正確反映實驗結果且能為膀胱相關疾病的治療服務，因此，本實驗根據國內外研究設計了4個速度:50、100、200和400 μL/min，并采用目前國內外常用的尿動力學［5］膀胱測壓方法——插管法［6－7］及造瘺法［8］進行灌注，觀察灌注過程中膀胱容量、壓力及膀胱傳入電活動的變化，擬初步探討灌注的不同速度及方法對膀胱功能的影響，為獲得適宜的灌注速度及灌注方法提供依據。

材料和方法

1 動物、主要藥品與儀器

SPF級SD大鼠，雌性，200～220 g，由廣州中醫藥大學實驗動物中心提供，許可證號為SCXK(粵) 2013－0020，合格證號為440005900000600，飼養在溫度(24±2)℃、濕度50%～70%的條件下，采用12 h晝夜間斷照明。動物實驗設施許可證號為SYXK (粵)2013－0085，使用證明號為00058727。

氯化鈉(天津市大茂化學試劑廠);烏拉坦(國藥集團化學試劑有限公司);BL420E型多通道生理信號采集處理系統(成都泰盟科技儀器有限公司);Laborie UDS－94型尿動力學檢查儀(Laborie);WZ－50C6型微量注射泵(浙江史密斯醫學儀器有限公司);測壓導管(測壓導管為測壓接頭連接3F硬膜外麻醉導管改造而成)。

2 方法

2.1 動物分組20只雌性SD大鼠隨機分為2組:造瘺法組采取導管經膀胱頂造瘺導入膀胱的方法進行灌注;插管法組采取導管沿尿道導入膀胱的方法進行灌注。每組10只，2組動物均以50、100、200和400 μL/min的速度分別進行灌注。

2.2 盆神經分離［3，8］大鼠以25%烏拉坦(1.0 g/ kg)全麻后，打開腹腔，輕輕推開腹腔腸道暴露后腹膜和盆腔腹膜。玻璃分針劃開后腹膜，沿盆神經節向中樞端分離盆神經(盆神經直徑約0.3 mm，長10～15 mm)。將腸道及一側子宮輕推至另一側后，可在髂血管分叉下方和膀胱后方形成一個類似三角形的凹陷空間，滴加37℃溫石油浸泡盆神經，保溫防干，同時便于將盆神經懸掛于電極而不與周圍組織接觸。分離好的大鼠盆神經懸掛于雙鉤鉑絲電極，參考電極連接于皮膚。通過加熱兔臺將大鼠肛溫控制在37℃左右。

2.3 膀胱容量、壓力及神經放電記錄打開BL420E型多通道生理信號采集處理系統，設置好實驗模式及測量參數后，連接電極。用螺旋調節器調整記錄電極與盆神經的接觸位置，觀察盆神經放電波形，以信噪比高、基線穩定、干擾少為效果佳。記錄盆神經傳入放電前，用眼科彎鑷夾斷盆神經中樞端，減少中樞端傳入電活動的影響［6］。

2.3.1 插管法沿尿道口緩緩導入3F導管。3F導管通過T型轉換接頭連接膀胱測壓管和灌注管，測壓管連接尿動力儀壓力傳感器，灌注管連接微量灌注泵。排空膀胱，待盆神經自發傳入放電恢復至基線水平，再按不同速度由低到高進行灌注(每次灌注前需待神經放電恢復至基線水平)，記錄灌注時間、膀胱壓力及神經傳入電活動情況，具體方法如下:體內置零，灌注前記錄盆神經自發傳入放電基線開啟微量注射泵向膀胱內灌注生理鹽水，此過程中注意觀察尿道外口有無液體溢出。液體溢出時記錄的膀胱壓即為膀胱漏尿點壓(bladder leak point pressures，BLPP);同時停止灌注，觀察膀胱壓力曲線，記錄其峰值，即為最大膀胱排尿壓(maximum voiding pressure，MVP);記錄此過程中膀胱神經傳入電活動，即盆神經放電，包括基線值及最大放電頻率，直至排尿過程完成后停止。計算膀胱最大容量(maximum bladder capacity，MBC)，MBC=灌注時間×灌注速度。

2.3.2 造瘺法于膀胱頂切開一小口，插入3F導管，2－0絲線結扎。此過程中注意切勿夾持膀胱以免對膀胱壁造成損傷。導管連接T型轉換接頭，其余操作與插管法一致。

2.4 參數設置模式(生物電)，采樣頻率(10 kHz)，掃描速度(2 s/div)，靈敏度(20 μV)，時間常數(0.001 s)，高頻濾波(3 kHz)，50 kHz陷波(打開)。

2.5 放電頻率分析用BL420E多通道生理信號采集處理系統，以1∶1信噪比為閾值分析;記錄60 s內的基線平均放電頻率作為基線值(baseline)，充盈過程中放電頻率最大值(10 s內平均值)作為最大放電頻率(maximum firing frequency)。首先確認盆神經的定位及功能是否正常，對膀胱進行緩慢灌注(30 μL/min)充盈，可誘發盆神經傳入放電頻率進行性增強，表明盆神經無明顯損傷，放電活動正常。

3 統計學處理

計量資料用均數±標準差(mean±SD)表示，采用SPSS 17.0統計軟件進行完全隨機設計的單因素方差分析(One－way ANOVA);以P＜0.05為差異有統計學意義。

結果

1 膀胱傳入電活動變化

研究結果顯示，2種方法比較，雖然造瘺法以50 μL/min的速度灌注時最大放電頻率及膀胱容量均比插管法低，但未顯示出顯著差異，而其它速度灌注時與插管法比較，各指標比較差異均有統計學意義(表1)，因此本研究以最低速度50 μL/min模擬生理性充盈速度，作為對照。

采用插管法以100 μL/min進行灌注，動物排尿過程中最大放電頻率與采用50 μL/min進行灌注時無顯著變化，而采用200 μL/min及400 μL/min進行灌注時，其最大放電頻率顯著升高(P＜0.05)。采用造瘺法以100、200和400 μL/min進行灌注，其最大放電頻率與采用50 μL/min進行灌注時均無顯著變化。2種方法相比，其基線值無顯著差異，但采用造瘺法以100、200和400 μL/min進行灌注，其最大放電頻率與插管法相比，均顯著下降(P＜0.05)，見表1。

表1 不同灌注速度及方法對盆神經放電的影響Table 1.The effects of different speeds and ways of instillation on pelvic nerve firing(Mean±SD.n=10)

2 膀胱容量、壓力變化

采用插管法以不同速度進行灌注，其膀胱最大容量比較穩定，無顯著變化;膀胱壓力(BLPP及MVP)隨著灌注速度的升高而增大，其中以100、200和400 μL/min進行灌注組比50 μL/min灌注組均高(P＜0.01)。采用造瘺法隨灌注速度增加，其MBC呈下降趨勢，其中以400 μL/min灌注組MBC比50 μL/min灌注組少(P＜0.05);膀胱壓力(BLPP及MVP)在不同灌注速度間無明顯變化。2種方法比較，造瘺法不同灌注速度測得的MBC均比插管法小(P＜0.05)，但在50和100 μL/min灌注組，造瘺法測得的壓力比插管法高(P＜0.05)，見表2。

表2 不同灌注速度及方法對膀胱容量、壓力的影響Table 2.The effects of different speeds and ways of instillation on bladder volume and pressure(Mean±SD.n=10)

3 插管法和造瘺法在不同速度下盆神經放電及膀胱壓力圖的變化

2種方法的不同速度灌注生理鹽水，所記錄的神經放電頻率變化均呈現出的反應模式為:放電頻率先于壓力達到峰值，而后壓力達到峰值時，放電頻率趨于平臺或下降［3］。從圖1、2中的尿動力曲線圖可見，采用插管法以不同速度進行灌注，儲尿期逼尿肌收縮峰比造瘺法要少，可能因為完整的膀胱壁結構有助于降低逼尿肌對容量刺激產生的不穩定收縮，防止排尿提前。

Figure 1.The diagram of pelvic nerve firing and bladder pressure with urethra insertion.A:speed at 50 μL/min;B:speed at 100 μL/min;C:speed at 200 μL/min;D:speed at 400 μL/min.圖1 插管法不同速度盆神經放電及膀胱壓力示意圖

Figure 2.The diagram of pelvic nerve firing and bladder pressure with bladder dome insertion.A:speed at 50 μL/min;B:speed at 100 μL/min;C:speed at 200 μL/min;D:speed at 400 μL/min.圖2 造瘺法不同速度盆神經放電及膀胱壓力示意圖

討論

膀胱由復雜且分布廣泛的神經支配。交感神經和副交感神經傳出纖維分別通過下腹神經和盆腔內臟神經傳至膀胱和尿道［2］。在膀胱測壓充盈膀胱過程中，可能存在3種明顯的感覺［9］:充盈初感、初排尿欲、強烈排尿欲。充盈初感可能只有在人為膀胱充盈時才被發覺，此感覺很弱，不恒定，可能依賴于皮層對其感受的波動。與排尿欲相關的沖動走行于盆神經內，排尿欲望來自于膀胱壁的牽張。而逼尿肌的收縮在儲尿排尿過程中也并非一成不變的［10］:在充盈過程中，逼尿肌的收縮表現為肌源性及自發性，發生在逼尿肌細胞或小單元;而排尿過程中，逼尿肌呈整體協調性收縮，以排空膀胱。膀胱充盈越快，膀胱順應性越低，逼尿肌不穩定收縮發生率越高，有效膀胱容量越小，越容易產生贗象［2］。Daly等［11］研究結果也顯示高速灌注對逼尿肌形成的刺激，可能使其產生不穩定收縮或排尿提前。本研究以50 μL/min的速度作為參照，結果顯示，插管法不同速度對膀胱容量未造成明顯影響，而逐漸升高的充盈速率使得盆神經放電及膀胱內壓的升高，與國外研究結果相符［11］。而采用造瘺法的動物，其膀胱容量隨著速度的增加呈下降趨勢，且在200及400 μL/min的速度顯示出顯著差異;其膀胱壓力及神經傳入電活動在各速度間無明顯變化?？赡苡捎谠殳浭中g使得神經體細胞沉默單元的機械刺激感受器及化學刺激感受器受損所致［3］。

Birder等［12］采用動物在麻醉狀態下進行實驗，顯示出C纖維對造瘺膀胱膨脹雖無明顯的反應，但認為感覺傳入電活動的小幅度降低可能是由C纖維引起的，其機制尚未明確。Yoshimura等［13］研究表明，膀胱的感覺神經傳入纖維包含有髓鞘的Aδ纖維和無髓鞘的C纖維。在鼠膀胱已證實Aδ纖維僅對膀胱充盈產生反應，表現為容量受體特性，對膀胱黏膜的牽張敏感。C纖維相對Aδ纖維具有高機械性閾值特征［14］。Szallasi等［15］研究發現無髓鞘感覺神經纖維(C纖維)存在多種活性成分，其中包括降鈣素基因相關肽(calcitoningene－relatedpeptide，CGRP)、P物質、血管活性腸肽、Y物質、ATP以及乙酰膽堿等。雖然Gabella等［16］發現膀胱頂黏膜沒有傳入軸突，但造瘺帶來的痛覺和傷害可能會激活C纖維致使逼尿肌對容量敏感性增加，提前收縮以完成排尿過程減少膀胱負荷，此機制仍需進一步研究;另一方面由于造瘺破壞了膀胱肌叢(myovesical plexus)的完整性可能導致興奮的過度傳入或抑制不足引起膀胱自主性活動過度增強［17］。

生理性水平的膨脹不會對膀胱容量造成影響，但如果灌注速率超出了正常膀胱尿液形成的速率水平，便會形成非生理性的傷害。病理性的改變如因疾病改變了逼尿肌對容量的適應性或因逼尿肌過度敏感，會使其在較小的尿液容量水平時產生收縮［11］。結合實驗結果及已有研究，插管法以不同速度進行灌注并未對膀胱容量造成明顯變化，但其膀胱內壓及神經放電頻率隨速度升高，使用此法應根據研究目的選擇灌注速度;而造瘺法以50和100 μL/min速度進行灌注對膀胱傳入電活動、容量及膀胱內壓無統計學差異，200及400 μL/min的灌注速度使膀胱容量明顯下降，可見該速度已經造成了非生理性刺激，使用此法進行研究應選用低于200 μL/min的速度進行灌注。

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Effects of different speeds and ways of instillation on bladder volume，pressure and pelvic nerve firing

LAI Huan－ling，LIANG Zhi－jian，WU Qing－he，HUANG Ping，CAO Hong－ying

(
Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510006，China.E-mail:hycao@gzucm.edu.cn)

AIM:To investigate the changes of bladder volume，pressures and pelvic nerve firing induce by different speeds and ways of instillation.METHODS:Female SD rats(n=20)were randomly divided into 2 groups.The rats in group A was performed using 3－F polyethylene tubing inserted into the bladder through the urethra.The rats in group B were performed using 3－F tubing inserted into the dome of the bladder and secured by silk suture.The rats in both groups were infused with saline into the bladder at different speeds of 50，100，200 and 400 μL/min.The changes of bladder volume and pressure were recorded by urodynamic measuring devices.The changes of pelvic nerve firing during instillation were recorded by multi－channel physiologic recorder.RESULTS:In group A，the maximum firing frequency，bladder leak point pressure(BLPP)and maximum voiding pressure(MVP)were increased with the increase in the instillation speed.No significant difference of the maximum bladder capacity(MBC)at different speeds was observed.In group B，the maximum firing frequency had no significant difference at different speeds.MBC was decreased with the increase in the instillation speed，and exhibited significant decrease at 200 and 400 μL/min.No significant difference of BLPP and MVP at different speeds was observed.Compared with group A，the maximum firing frequency and MBC in group B significantly decreased at different speeds.However，BLPP and MVP in group B were higher than those in group A at the speeds of 50 and 100 μL/min.CONCLUSION:Different instillation speeds with the method of group A will not change the bladder volume but influence the pelvic nerve firing，so the process of method A may take various speeds according to different aims.However，process of method B at the speed of over 200 μL/min may not be good to MBC，thus instillation under 200 μL/min is re－commended.

Instillation speed;Urethral catheterization;Bladder dome insertion;Bladder capacity;Bladder pressure

R33－33

A

10.3969/j.issn.1000－4718.2015.02.034

1000－4718(2015)02－379－06

2014－09－28

2014－10－29

國家自然科學基金資助項目(No.81202982)

△通訊作者Tel:020－39358086;E－mail:hycao@gzucm.edu.cn