蛇床子素對人肝癌細胞生長和TGF－β誘導侵襲轉移的干預作用

王錦軍

蛇床子素對人肝癌細胞生長和TGF－β誘導侵襲轉移的干預作用

王錦軍

目的 觀察蛇床子素對人肝癌細胞HepG2的殺傷及侵襲轉移的影響。方法 將人肝癌細胞HepG2用不同濃度的蛇床子素干預后，采用MTT法檢測蛇床子素對HepG2細胞增殖的抑制作用；PI染色流式細胞術檢測細胞內DNA含量，測定蛇床子素對HepG2細胞周期的影響；采用transwell技術檢測HepG2細胞在TGF－β培養體系中蛇床子素對細胞侵襲力的影響；Western blot檢測腫瘤侵襲力相關蛋白MMP－9和vimentin的表達。結果 與對照組比較，蛇床子素對HepG2細胞有顯著的抑制作用（P＜0.05）；蛇床子素各濃度組48h與24h比較，差異有統計學意義（P均＜0.05）；蛇床子素各濃度組72h與48h比較，差異有統計學意義（P均＜0.05）；蛇床子素100、150、200μM濃度組與對照組比較，差異有統計學意義（P均＜0.05）；蛇床子素150與100μM濃度組比較，差異有統計學意義（P均＜0.05）；蛇床子素200與150μM濃度組比較，差異有統計學意義（P均＜0.05）；蛇床子素加TGF－β各濃度組細胞個數明顯低于對照組（P均＜0.05）；100、150、200μM蛇床子素加TGF－β組MMP－9表達量與對照組比較，差異有統計學意義（P均＜0.05）；100、150、200μM蛇床子素加TGF－β組vimentin表達量與對照組比較，差異有統計學意義（P均＜0.05）；蛇床子素加TGF－β各濃度組間細胞個數、MMP－9、vimentin表達量比較，差異有統計學意義（P均＜0.05）。結論 蛇床子素能抑制人肝癌細胞的生長和侵襲轉移。

肝癌；腫瘤侵襲；蛇床子素；HepG2；TGF－β；MMP－9

肝細胞肝癌是世界上最常見的肝臟原發性惡性腫瘤，約占腫瘤總發病率的5.6%[1]。肝癌的不良預后和高侵襲轉移性以及對常規治療手段如化療放療的高抵抗性導致肝癌居癌癥死亡率的第三位[2]。癌細胞屬于上皮細胞來源，然而在腫瘤發展過程中腫瘤細胞逐漸失去上皮細胞特征并獲得間充質細胞特性，這一過程稱之為上皮細胞間質轉型（EMT）[3]。EMT是腫瘤侵襲轉移的關鍵過程，是腫瘤發展和致死的關鍵因素[4]。在EMT過程中，腫瘤微環境中的TGF－β是重要的調節因子，它通過信號轉導通路上調間充質細胞骨架蛋白如波形蛋白（vimentin）及基質金屬蛋白酶－9（MMP－9）等促進腫瘤細胞侵襲正常組織并發生腫瘤轉移[5－7]。蛇床子素（osthole）是從中藥蛇床子中提取的活性物質，研究發現蛇床子素具有抗濕疹、皮膚瘙癢，抗炎癥，抗肝炎以及抗腫瘤作用[8－10]。蛇床子素對于多種腫瘤均具有良好抑制作用，然而其對人肝癌細胞生長和侵襲轉移的抑制作用卻很少報道。本研究觀察蛇床子素對人肝癌細胞系HepG2的生物效應，探討其對肝腫瘤細胞的生長和侵襲轉移的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞培養 人肝癌細胞HepG2細胞系購于ATCC（American Type Culture Collection,美國模式培養物研究所），培養在RPMI－1640培養基中，含10%胎牛血清，100U/L青霉素和100mg/mL鏈霉素，培養環境為37℃恒溫且通入5%的CO2。

1.2 試 劑 RPIM－1640培養基購于Gibco公司，胎牛血清購于杭州四季青生物工程有限公司，transwell小室購于美國康寧公司；蛇床子素、二甲亞砜、MTT、碘化丙啶（PI）購于美國Sigma公司；βactin、MMP－9、vimentin抗體購自美國Cell signal公司。

1.3 細胞增殖抑制試驗 將HepG2細胞按2×103/孔接種于96孔板，加入 200μL含10%FBS的RPIM－1640培養，設置3個復孔，并分別加入0（對照組）、50、100、150和200μM的蛇床子素培養24、48及72h，加5mg/mL MTT 20μL，繼續培養4h。棄上清，往孔中加150μL DMSO，震蕩使紫色絮狀物完全溶解，570nm波長下用酶標儀檢測OD值，腫瘤細胞生長抑制率=（OD對照組－ODosthole）/OD對照組× 100%。

1.4 細胞周期檢測 在HepG2細胞中分別加入0（對照組）、50、100、150和200μM的蛇床子素培養48h，收集細胞用生理鹽水洗2次，用70%乙醇在4℃固定過夜后用生理鹽水清洗，加入（50μg/mL）RNA酶，100μg/mL PI在暗處染色30min后立即用流式細胞儀檢測細胞周期，G2期細胞所占比率可表示為腫瘤細胞進入G2/M阻滯[11]。

1.5 腫瘤細胞侵襲試驗 在transwell小室中接種1×104個HepG2細胞置于24孔板中，上室培養基為無血清RPMI－1640培養基并加入2ng/mLTGF－β及各濃度蛇床子素，下室培養基為含10%胎牛血清的RPMI－1640。培養24h后取出transwell小室，用生理鹽水洗去小室內的細胞，將transwell膜用3%多聚甲醛固定15min后用0.1%結晶紫染色20min，低倍鏡（×100）觀察4個隨機選擇的區域，計算細胞總數。

1.6 Western blot試驗 在HepG2細胞中分別加入不同濃度的蛇床子素培養24h，然后將細胞裂解后做Western blot檢測MMP－9和Vimentin的表達，蛋白表達量由它們在膠片上顯色后的灰度與相應βactin的灰度比表示。

1.7 統計學方法 所有實驗重復3次，實驗數據用均值±標準差（±s）表示，應用SPSS10.0軟件處理數據，采用非配對雙邊t檢驗以及單因素方差分析，P＜0.05認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 蛇床子素對人肝癌細胞系HepG2的抑制作用與對照組比較，蛇床子素各劑量組均呈現出抑制效應，呈劑量依賴性,且隨著蛇床子素治療時間的延長，對腫瘤細胞生長的抑制作用顯著增加。見表1，圖1。

表1 蛇床子素對HepG2細胞的抑制作用（±s）

表1 蛇床子素對HepG2細胞的抑制作用（±s）

注：與對照組比較,*P＜0.05；與24h比較，▲P＜0.05；與48h比較，△P＜0.05

組別對照組蛇床子素組孔數 抑制率（%）33333濃度（μM）0 50 100 150 200 24h 0 5.4±1.7* 16.2±3.1* 31.4±4.8* 40.2±5.1* 48h 0 8.7±3.5* 27.8±4.7*▲48.5±4.3*▲66.3±5.9*▲72h 0 19.4±3.6*△48.4±4.4*△78.1±6.9*△87.6±7.0*△

圖1 蛇床子素對HepG2細胞抑制作用

2.2 蛇床子素通過G2/M阻滯抑制HepG2細胞周期

流式細胞術檢測結果顯示，當蛇床子素濃度達到150μM時，進入G2期的HepG2細胞從對照組的1.9%增加到15.4%，表明蛇床子素對HepG2細胞有G2/M阻滯作用，使腫瘤細胞的增殖周期停滯，從而抑制和殺傷肝腫瘤細胞。見表2。

表2 蛇床子素對HepG2細胞周期的阻滯效應（±s）

表2 蛇床子素對HepG2細胞周期的阻滯效應（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與100μM組比較，▲P＜0.05；與150μM組比較，△P＜0.05

組別對照組蛇床子素組孔數33333濃度（μM）0 50 100 150 200 G2/M阻滯（%）1.9±0.2 3.2±0.4 6.7±1.6* 15.4±2.7*▲20.6±3.6*△

2.3 蛇床子素抑制TGF－β誘導的腫瘤侵襲轉移將HepG2細胞用不同濃度的蛇床子素處理48h，顯微鏡計數transwell膜上的細胞數測定HepG2細胞的侵襲能力。結果發現隨著蛇床子素劑量的增加，transwell膜上的細胞數顯著減少（見表3），表明蛇床子素能抑制肝腫瘤的侵襲和轉移。為了在蛋白水平上進一步研究蛇床子素對HepG2細胞侵襲能力的影響，采用Western blot法檢測TGF－β誘導的侵襲相關蛋白MMP－9和Vimentin表達，發現隨著蛇床子素劑量的增加，MMP－9和Vimentin表達降低，表明蛇床子素通過下調HepG2細胞MMP－9和Vimentin表達抑制TGF－β依賴的腫瘤侵襲能力。見表3，圖2。

圖2 蛇床子素對TGF－β處理的HepG2細胞轉移相關蛋白表達的抑制作用

表3 蛇床子素對HepG2細胞侵襲能力的抑制作用（±s）

表3 蛇床子素對HepG2細胞侵襲能力的抑制作用（±s）

注：實驗Ⅰ組：50μM蛇床子素+TGF－β；實驗Ⅱ組：100μM蛇床子素+TGF－β；實驗Ⅲ組：150μM蛇床子素+TGF－β；實驗Ⅳ組：200μM蛇床子素+ TGF－β；與對照組比較，*P＜0.05；與實驗Ⅰ組比較，▲P＜0.05；與實驗Ⅱ組比較，▼P＜0.05；與實驗Ⅲ組比較，△P＜0.05

組別對照組TGF－β組實驗Ⅰ組實驗Ⅱ組實驗Ⅲ組實驗Ⅳ組孔數333333 TGF－β濃度（ng/mL）022222蛇床子素濃度（μM）005 0 100 150 200細胞個數（個）125.4±21.7 432.8±44.9 381.6±41.5* 285.3±39.8*▲134.8±22.5*▼101.6±23.7*△MMP－9/β－actin 0.24±0.05 0.69±0.09 0.63±0.09 0.50±0.08*▲0.33±0.04*▼0.18±0.03*△vimentin/β－actin 0.28±0.04 0.62±0.08 0.58±0.07 0.46±0.06*▲0.29±0.05*▼0.21±0.04*

3 討論

腫瘤生長微環境中的TGF－β與腫瘤發生EMT有密切的聯系，腫瘤的侵襲能力依賴于TGF－β的信號轉導通路，當TGF－β與Ⅱ型TGF－β受體結合后激活Ⅰ型TGF－β受體，Ⅰ型TGF－β受體是一種跨膜絲氨酸/蘇氨酸激酶，它能進一步使轉錄因子Smads2和Smads3發生磷酸化激活，從而上調侵襲相關蛋白如MMP－9和vimentin的表達促進EMT的發生[12－13]。

文獻報道很多天然藥物具有十分顯著的抗肝腫瘤作用，并且有高效、低毒、高腫瘤選擇性的特點，有很大的研究價值[14－15]。蛇床子素是一種天然藥物，在臨床上已經大量應用，證實了它的低毒低副作用特性。本研究發現蛇床子素還具有十分良好的抗肝腫瘤細胞增殖的生物活性。此外，蛇床子素還能顯著抑制TGF－β誘導的腫瘤侵襲效應，表明蛇床子素能減少肝癌細胞的侵襲和轉移，對肝腫瘤患者的預后起到十分積極的作用。本研究結果提示蛇床子素可能在人肝癌治療中有廣闊的應用前景。

［1］Sherman M.Hepatocellular Carcinoma：Epidemiology，Surveillance,and Diagnosis［J］.Semin Liver Dis，2010，30（1）：3－16.

［2］Enguita－Germán M，Fortes P.Targeting the insulin－like growth factor pathway in hepatocellular carcinoma［J］.World J Hepatol，2014，6（10）：716－737.

［3］Zhu QC，Gao RY，Qin HL，et al.Epithelial－mesenchymal transition and its role in the pathogenesis of colorectal cancer［J］.Asian Pasific J Cancer Pre，2013，14（5）：2689－2698.

［4］Xu J，Lamouille S，Derynck R.TGF－beta－induced epithelial to mesenchymal transition［J］.Cell Res，2009，19（2）：156－172.

［5］Munger JS，Sheppard D.Cross talk among TGF－b signaling pathways，integrins，and the extracellular matrix［J］.Cold SpringHarb PerspectBiol，2011，3（11）：a005017.

［6］Sipos F，Galamb O.Epithelial-to-mesenchymal and mesenchymal-toepithelial transitions in the colon［J］.World J Gastroenterol，2012，18（7）：601-608.

［7］Zhang B，Halder SK，Kashikar ND，et al.Antimetastatic role of Smad4 signaling in colorectal cancer［J］.Gastroenterology，2010，138（3）：969-980.

［8］Balayssac S，Gilard V，Malet-Martino M，et al.Analysis of herbal dietary supplements for sexual performance enhancement：first characterization of propoxyphenyl-thiohydroxyhomosildenafil and identification of sildenafil，thiosildenafil，phentolamine and tetrahydropalmatine as adulterants［J］.J Pharm Biomed Anal，2012，63：135-150..

［9］Lin YC，Lin JC，Way TD，et al.Osthole inhibits insulin-like growth factor-1-induced epithelial to mesenchymal transition via the inhibition of PI3K/Akt signaling pathway in human brain cancer cells［J］.J Agric Food Chem，2014，62（22）：5061-5071

［1 0］Gao Z，Wen Q，Zou S.Osthole augments therapeutic efficiency of neural stem cells-based therapy in experimental autoimmune encephalomyelitis［J］.J Pharmacol Sci，2014，124（1）：54-65.

［1 1］Kong Y，Chen J，Chen C，et al.Cucurbitacin e induces cell cycle g2/m phase arrest and apoptosis in triple negative breast cancer［J］.PLoS One，2014，9（7）：e103760.

［1 2］Lampropoulos P，Zizi-Sermpetzoglou A，Papavassiliou AG，et al.TGF-beta signalling in colon carcinogenesis［J］.Cancer Lett，2012，314（1）：1-7.

［1 3］Sipos F，Galamb O.Epithelial-to-mesenchymal and mesenchymal-toepithelial transitions in the colon［J］.World J Gastroenterol，2012，18（7）：601-608.

［1 4］Lachenmayer A，Alsinet C，Llovet JM，et al.Molecular approaches to treatment of hepatocellular carcinoma［J］.Digestive and Liver Disease，2010，3：S264-S272.

［1 5］Song G，Luo Q，Shi Y，et al.Effects of oxymatrine on proliferation and apoptosis in human hepatoma cells［J］.Colloids and Surfaces B：Biointerfaces，2006，48（1）：1-5.

（收稿：2014-08-07 修回：2014-11-03）

Osthole Inhibited The Growth and TGF-β-induced Invasion of Human Hepatocellular Carcinoma

WANGJinjun.The Central Hospital of Jinhua City,Jinhua(321000),China

Objective To investigate the effects of osthole on proliferation and invasion of hepatocellular carcinoma HepG2 cells.Methods HepG2 cells were treated with various concentrations（50,100,150,200μM）of osthole.The proliferation of osthole－treating HepG2 cells was measured by using MTT assay.Cell cycle of the HepG2 cells treated with osthole was evaluated by flow cytometry with PI staining.The effect of osthole on invasion induced by TGF－β was measured by transwell method.The expressions of invasion related proteins MMP9 and vimentin were detected by Western blot.Results Compared with control group,osthole significantly inhibited the growth of HepG2 cells（P＜0.05）.The growth of HepG2 cells in all osthole groups was different between 24h treatment and 48h treatment and between 72h treatment and 48h treatment（all P＜0.05）.Significant difference in HepG2 cell growth was found between 100,150,200μM of osthole group and control group（all P＜0.05）,between 150μM and 100μM of osthole groups（P＜0.05）,and between 200μM and 150μM of osthole groups（P＜0.05）.Compared with control group,the HepG2 cell growth,the expression of MMP－9 and vimentin in all osthole plus TGF－β groups was significantly different（all P＜0.05）.The cell count and the expression of MMP9 and vimentin were statistically different among different concentration of osthole plus TGF－β groups（all P＜0.05）.Conclusion Osthole can inhibit the growth and invasion in hepatocellula carcinoma.

hepatocellular carcinoma;tumor invasion;osthole;HepG2;TGF－β;MMP－9

浙江省金華市中心醫院兒一科（金華 321000）