子宮內膜異位癥對小鼠生育能力的影響

崔陽陽，孫偉偉，趙瑞華*，徐彩，吳天思，2

（1.中國中醫科學院廣安門醫院婦科，北京 100053；2.北京中醫藥大學，北京 100029）

研究報告

子宮內膜異位癥對小鼠生育能力的影響

崔陽陽1，孫偉偉1，趙瑞華1*，徐彩1，吳天思1，2

（1.中國中醫科學院廣安門醫院婦科，北京 100053；2.北京中醫藥大學，北京 100029）

目的建立子宮內膜異位癥小鼠模型，觀察子宮內膜異位癥對模型小鼠妊娠能力的影響。方法通過“腹腔+皮下”同系異體子宮內膜注射法建立子宮內膜異位癥小鼠模型，與假手術組、空白組比較，觀察其妊娠率及活胎率，觀察子宮內膜異位癥對模型小鼠妊娠能力的影響。結果建模2周后，小鼠皮下和腹腔均見有子宮內膜異位病灶生成，模型組、假手術組和空白組，共三組。通過生育功能檢測，三組妊娠率差異有顯著性意義（P＜0.05）。三組的活胎數差異有顯著性意義（P＜0.05）。結論成功建立子宮內膜異位癥小鼠模型，并證實子宮內膜異位癥可影響模型小鼠生育功能。

子宮內膜異位癥；小鼠；生育功能

子宮內膜異位癥（endometriosis，EM），是一種常見的雌激素依賴性疾病，是育齡婦女最常見的疾病之一，簡稱內異癥。內異癥患者并發不孕高達40%～60%，而在不孕癥患者中也有40%～50%存在子宮內膜異位癥［1］，內異癥患者不孕為非內異癥人群的20倍［2］。可見，內異癥與不孕癥存在緊密聯系。2000年Buyalos等［3］首次提出“內異癥相關不孕”。本研究以中醫理論為指導，在前期工作的基礎上，通過建立子宮內膜異位癥小鼠模型，探討EM對小鼠妊娠能力的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

SPF級KM小鼠，雌性，7周齡，體重（25±3）g，40只，雄性，10周齡，體重（33±2）g，10只。所有實驗動物購自北京華阜康生物科技股份有限公司【SCXK（京）2009-0007】。實驗動物飼養于中國中醫科學院廣安門醫院SPF級動物實驗室【SYXK（京）2009-0034】，燈光（12L：12D），室溫22℃。飼養動物所需的籠具及飲水瓶均由專業飼養人員高壓滅菌后提供。雌性KM小鼠用于模型小鼠的供體、受體及空白對照，雄性KM小鼠用于與雌鼠合籠。

1.1.2 實驗藥物

苯甲酸雌二醇購自寧波第二激素廠（中國，浙江，批號：110252511）。HE染色由北京大學醫學部病理實驗室進行操作。其余所有的實驗藥物及試劑均來自于中國中醫科學院廣安門醫院免疫實驗室。

1.2 方法

1.2.1 子宮內膜異位癥小鼠模型的建立［4］

模型建立前，選擇動情周期正常的小鼠［5］作為模型小鼠的內膜的供體以備移植注射，供體小鼠皮下注射苯甲酸雌二醇（E2）促進內膜生長并且使內膜易于剝離。模型建立的實驗過程皆在無菌條件下進行操作。

脫頸處死供體小鼠，常規消毒后小鼠腹部并做一5 cm的切口暴露子宮，剪下子宮將其置于盛有生理鹽水的培養皿中（含100 U/mL青霉素，100 U/ mL鏈霉素）。用鹽水沖洗子宮，盡可能去除子宮上附著的多余脂肪組織、血塊及雜質，使用“滾針法”細心剝離子宮內膜［6］。將完整的管狀子宮內膜縱形剖開，剪成1 mm×1 mm的小碎片以備注射使用（如圖1）。

受體小鼠以0.9%水合氯醛腹腔注射進行麻醉，腹部常規消毒備用，將以16號針頭吸取0.2 mL的子宮內膜碎片懸液（含4～8個小碎片）分別進行腹腔注射與皮下注射［7ˉ8］。次日，小鼠皮下注射0.02 mL E2（1 mg/mL），促進接種內膜生長，以5 d為一周期，持續3個周期。每日腹腔注射青霉素1萬單位，連續5 d以預防感染。假手術組給予注射等量生理鹽水。空白組不給予任何處理。所有小鼠注射的傷口恢復良好，體征正常，無不良反應。模型建立的操作由第一作者完成。

1.2.2 子宮內膜異位癥KM小鼠模型異位病灶取材及標本處理

子宮內膜異位癥小鼠模型的異位病灶于2.4實驗步驟處死小鼠時同步取材［4］。將取出的異位病灶用生理鹽水沖洗干凈，去除多余的脂肪組織和血塊后，將標本置于4%中性甲醛固定24 h后，梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，連續切片，常規HE染色。HE染色的操作人員不被告知實驗組別。于倒置顯微鏡下觀察異位內膜的組織形態學結構及特點。

1.2.3 子宮內膜異位癥小鼠成模判斷標準

子宮內膜異位癥小鼠建模成功判斷標準是根據EMs的病理診斷標準［9］而定，鏡下出現子宮內膜，腺體或腺體樣結構，間質和出血這4種改變的2種可判斷模型建立成功。

1.2.4 子宮內膜異位癥KM小鼠模型妊娠能力的觀察

建模2周后，將三組雌鼠分別與以2∶1與性成熟雄鼠合籠，次日清晨見陰栓者視為交配成功，定為妊娠第1天。于合籠后第7天處死小鼠，觀察妊娠率及活胎數，其判斷標準［10］如下：妊娠率：妊娠率=妊娠只數/見栓只數；活胎：妊娠7d，孕體鮮明，判為存活；活胎率：活胎率=活胎數/總胎數。

1.2.5 統計學方法

2 結果

2.1 子宮內膜異位癥小鼠模型異位病灶觀察

建模2周后，模型小鼠腹部皮下手可觸及米粒大小的結節，活動度較好。子宮內膜異位癥小鼠模型［4］的觀察結果如下（如圖2ˉ6）：小鼠皮下病灶，多為紅色、白色或暗紅色的米粒大小的結節；小鼠腹腔內病灶，多為隆起囊泡或結節，囊泡內充滿淡黃色清亮透明或混濁粘稠液體。皮下和腹腔內病灶表面皆有血管網覆蓋并清晰可見。肉眼觀察下，在模型小鼠皮下和腹腔均可見病灶生成，小鼠皮下及腹腔有不同程度的粘連，而腹腔內粘連較嚴重。通過病灶的HE染色可見：切片中可見有血管生成，并有大量腺體和間質存在。本次建模共14只小鼠，僅1只未在腹腔及皮下找到病灶，僅見腹腔及皮下粘連，成功建模13只，可見，子宮內膜異位癥小鼠“腹腔+皮下”注射法建立模型的成功率達90%以上。

圖2 子宮內膜異位癥小鼠模型皮下內異位癥灶Fig.2 Ectopic lesions of endometriosis in the subcutaneous tissue in themodelmice

圖3 子宮內膜異位癥小鼠模型腹腔內異位癥灶Fig.3 Ectopic lesions of endometriosis in the abdominal cavity ofmodelmice

2.2 子宮內膜異位癥模型小鼠妊娠率及活胎數

采用Fisher精切概率法，三組妊娠率差異有顯著意義（P＜0.05）。通過兩兩比較，模型組妊娠率明顯低于假手術組與空白組（P＜0.05）；而假手術組與空白組的妊娠率差異無顯著性（P＞0.05）（見表1）。

采用非參數檢驗，三組的活胎數差異有顯著性（P＜0.05）。通過兩兩比較，模型組的活胎數明顯低于假手術組與空白組（P＜0.05），而假手術組與空白組的活胎數差異無顯著性（P＞0.05）（見表2）。

注：A：正常子宮內膜；B：異位子宮內膜；C：異位子宮內膜圖4 子宮內膜異位癥小鼠模型腹腔內異位癥灶（標尺=300μm）Note.A：Normal endometrium；B：Ectopic endometrium；C：Ectopic endometriumFig.4 Ectopic endometriotic lesions in the abdominal cavity ofmodelmice.Bar=300μm.

圖5 子宮內膜異位癥小鼠模型異位癥灶（標尺=100μm）Fig.5 Ectopic endometriotic lesions in themodelmice.Bar=100μm.

注：A正常內膜（標尺=50μm）；B異位內膜（標尺=25μm）圖6 正常內膜和子宮內膜異位癥小鼠模型異位內膜Note.A：Normal endometrium（Bar=50μm）；B：Ectopic endometrium（Bar=25μm.）Fig.6 Normal endometrium（A）and ectopic endometriotic lesions（B）in themodelmice.

表1 三組妊娠率比較Tab.1 Comparison of pregnancy rates in the three groups

表2 各組活胎數比較Tab.2 Comparison of live embryo number in the three groups

3 討論

內異癥是一種常見的、多發的良性婦科疾病，具有侵襲性和復發性。子宮內膜異位癥的最佳診斷方法為腹腔鏡檢查，而腹腔鏡是有創性的檢查。內異癥這種疾病僅自發于人類和靈長類動物，因此，關于子宮內膜異位癥的研究受到實際操作和倫理道德因素的限制而無法對子宮內膜異位癥患者進反復進行創傷性檢查，或進行具有侵襲性的EM對照試驗研究。因此，動物模型則成為研究該內異癥的一個主要方式及重要手段。目前，國內外EM動物模型在狒狒、猴、巴馬香豬、兔、大鼠和小鼠等動物中都已有研究和發展。其中以兔和鼠最為常用，自發性EM動物模型以有月經周期的靈長類動物為實驗動物，但因發病率低且代價昂貴而限制了在EM模型中的應用。誘發性EM動物模型以子宮內膜不發生脫落的動情動物為主，如：兔、鼠等。現有的模型大多是以自體移植誘導模型為主，移植方法是將動物自體的子宮內膜縫合到其腹膜、子宮系膜或腸系膜上，此法雖然能形成病灶且生長良好，但病灶深藏于動物腹腔體內，須進行二次手術進行探查。此法建立的動物模型不能保留完整子宮，限制了子宮內膜異位癥關于子宮內膜、妊娠、胚胎方面的研究。為了減少動物內膜和人類內膜存在的種屬和生化方面的差異，研究者故將免疫缺陷的裸鼠和嚴重聯合免疫缺陷（SCID）小鼠作為實驗研究對象，其模型建立方法是將人類的子宮內膜移植于小鼠腹腔［11，12］或皮下［13］，模型成功率可高達100%。但裸鼠價格較高，且免疫缺陷小鼠不能用于免疫方面的研究。馬麗等實驗研究根據可靠的組織學觀察發現，免疫功能正常的ICR小鼠模型建立成功率可達83.3%，小鼠在價格和免疫學［14］研究應用方面很大的優勢。針對于大鼠和兔模型，小鼠模型在某些方面有極大優勢。如小鼠對E2的敏感性要超過大鼠等。

本實驗選用KM小鼠，因其動情周期短而規律、性成熟早、繁殖力強、生存及適應能力強，免疫功能正常，價格適宜。通過“腹腔+皮下”同種異體子宮內膜注射法建立EM小鼠模型。實驗研究結果發現，假手術組的妊娠率和活胎數與空白組比較無明顯差異（P＞0.05），這表明小鼠的妊娠功能并未受到“腹腔+皮下”內膜注射法整個操作過程的影響。而利用此方法建立模型較傳統開腹自體移植等造模方法相比，對動物創傷小，可在一定程度避免腹腔手術操作、線結異物刺激對盆腔微環境可能產生的影響，減少動物感染、死亡的發生。同時“皮下+腹腔”的疊加方法，不僅有利于觀察異位病灶的生長帶來方便，避免二次開腹探查，而且也不會脫離腹腔環境，使異位病灶依附于腹腔微環境之中。采用該方法建立的EM小鼠模型異位病灶肉眼可見，形態典型、易觀察，病灶生長部位分散且易見粘連帶，符合人類內異癥的發病特征。經HE染色的病理組織學驗證，其造模成功率可達90%以上，故以“腹腔+皮下”同種異體子宮內膜注射法建立EM KM小鼠模型是一種較優的動物模型。

本研究結果顯示，模型組的妊娠率、活胎數均明顯低于假手術組和空白組（P＜0.05），假手術組的妊娠率和活胎數與空白組比較無明顯差異（P＞0.05），這表明從動物實驗角度驗證，內異癥可降低小鼠的妊娠功能，通過本實驗造模方法所建立的EM小鼠模型，既保留了小鼠的完整雙子宮，又保持較強的生命活力，這與傳統自體移植建模方法相比，該模型更適用于子宮內膜異位癥相關不孕、生育能力、妊娠、輔助生殖及后續程序繁瑣等實驗研究，可作為內異癥相關不孕研究的理想動物模型，為子宮內膜異位癥相關不孕的基礎研究提供了良好的研究手段和對象。

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Fffects of endometriosis on the reproductive ability ofm ice

CUIYang-yang1.2，SUNWei-wei1，ZHAO Rui-hua1*，XU Cai1，WU Tian-si1，2
（1.Department of Gynecology，Guang＇anmen Hospital，China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing 100053，China；2.Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100029）

ObjectivesThe aim of the study was to establish amousemodel of endometriosis，and to observe the effects of endometriosis on the reproductive ability in themice.M ethodsThemousemodels of endometriosiswas established by subcutaneous and intraperitoneal injection of heterogenous endometrium.The pregnancy rate and live embryo number in the experimental，sham operation and blank groupswere observed and compared，and the effects of endometriosis on reproductive ability of themice were evaluated.ResultsTwo weeks after the establishment of the mouse model of endometriosis，there were lesions in the peritoneal cavity and subcutaneous tissue of the mice.Compared the pregnancy rates among themodel group，sham operation group and blank group，the differences were statistically significant（P＜0.05）.Compared the live embryo number in the three groups，there were also significant differences（P＜0.05）.ConclusionsA mousemodel of endometriosis is successfully established，and it demonstrates that endometriosismay affect the reproductive ability ofmice.

Endometriosis；Mouse；Reproductive ability

Q95-33

A

1005-4847（2015）05-0479-05

10.3969/j.issn.1005ˉ4847.2015.05.007

2015-05-05

國家自然科學基金（No：81173297）。

崔陽陽（1987年ˉ），女，碩士，專業：中醫婦科學。Tel：18810465649，E-mail：cuiyang870216@163.com

趙瑞華，女，博士生導師，研究方向：子宮內膜異位癥、不孕癥、月經失調方向。Tel：010-88001139，E-mail：rhzh801@126.com