β淀粉樣蛋白1～42促進神經細胞凋亡

申茉函 王全才 楊 麗

(中國醫科大學附屬盛京醫院，遼寧 沈陽 110004)

阿爾茨海默病(AD)的主要病理特征是細胞外老年斑的形成和細胞內神經纖維纏結的集聚，而β淀粉樣蛋白(Aβ)是老年斑的主要成分，在老年斑的形成過程中具有神經元毒性，其作用依賴于多肽的聚集狀態與蛋白濃度，主要的毒性片段是 Aβ1～42，是 AD 的主要致病原因。本實驗研究 Aβ1～42對U251細胞的影響，觀察其損傷細胞的途徑，以討論AD的發病機制。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器 人神經膠質瘤細胞U251由中國醫科大學基礎醫學院饋贈;重組人 Aβ1～42(rhAβ1～42)已制備并純化;DMEM培養基購自Gibco公司;AO購自北京鼎國生物技術有限公司;EB購自美國Sigma公司;β-actin、Bax、Bcl-2抗體(北京博士德公司)。rhAβ1～42在37℃溫箱孵育7 d。

1.2 U251的培養及擴增 人神經膠質瘤細胞U251的培養選用DMEM高糖培養基，含10%小牛血清，在37℃、5%CO2濕化培養箱中培養。0.25%胰酶消化后分瓶傳代。

1.3 形態學觀察 取對數生長期的U251細胞，向培養液中分別添加0.5、1、5、10和20μmol/L的Aβ1～42，以未加者為對照組，培養24 h后，加入AO/EB染料于共聚焦顯微鏡下觀察。

1.4 MTT試驗 細胞生長至約80%鋪滿表面時，以0.25%胰酶溶液消化，用含10%小牛血清的相應培養液制成單細胞懸液，細胞濃度調整為6×106/ml。每孔100μl接種96孔培養板中，培養 24 h，再向培養液中分別添加 0.5、1、5、10 和 20、30 μmol/L的 Aβ1～42，每個濃度組 4 復孔，每孔加入 5 g/L 的MTT 20μl，于37℃培養箱中培養4 h后，吸出上清液，每孔加入150μl的二甲基亞砜(DMSO)，充分震蕩使細胞溶解，用酶標儀于570 nm波長處測定各孔吸光度A值，計算U251細胞對藥的生長抑制率。細胞生長抑制率(%)=〔1－實驗組A值/對照組A值〕×100%。

1.5 透射電鏡 Aβ1～42加入體外培養7 d的神經干細胞，使其終濃度為10μmol/L。37℃孵育48 h后，對照組加入與實驗組等體積的培養液。收集細胞，PBS洗3次，離心，沉淀用4%戊二醛固定，4℃放置2 h。1%鋨酸4℃固定1 h;棄去鋨酸培養液，PBS洗2次，每次20 min。0.5%醋酸雙氧鈾預染，室溫，搖床過夜。30%、50%、70%、90%、100% 梯度乙醇脫水各15 min;最后用100%乙醇脫水2次，每次10 min。Epon812環氧樹脂包埋，LKB-Ⅲ型超薄切片機半薄切片定位后做超薄切片。1%醋酸雙氧鈾與檸檬酸鉛雙重染色。JEM-1200EX透射電子顯微鏡觀察，拍照。

1.6 Western印跡檢測Bax、Bcl-2蛋白表達 作用24 h后分別收集空白對照組、Aβ1～42終濃度分別為 0.5，1，5，10 和20μmol/L劑量組的細胞，PBS洗3次，加入預冷的細胞裂解液，裂解后離心取上清，用Bradford法測定各種蛋白的濃度。分別取蛋白樣品，按體積比4∶1加入上樣緩沖液，100℃、5 min變性，經SDS-PAGE(5%濃縮膠，18%分離膠)電泳分離后，將蛋白電轉印于硝酸纖維素膜，經脫脂奶粉封閉液封閉，將硝酸纖維素膜分別加入稀釋后一抗，再用相應辣根過氧化物酶(HPR)標記的二抗稀釋液孵育，用ECL發光法檢測不同樣品各種蛋白表達狀況。以Bio-Rad圖像分析系統分析圖像，用目的蛋白條帶的平均光強度值與β-actin條帶的平均光強度值的比值表示該蛋白表達的相對強度。

1.7 統計學分析 應用SPSS13.0軟件行t檢驗。

2 結果

2.1 rhAβ1～42對U251細胞增殖能力的影響 MTT法檢測結果顯示，不同濃度rhAβ1～42作用U251細胞24 h后，對細胞增殖顯示出一定的抑制作用(P＜0.05或P＜0.01 vs陰性對照組)。當rhAβ1～42作用濃度為20μmol/L時，對腫瘤細胞增殖抑制率最高，為27.55%(P＜0.01 vs陰性對照組);提高 rhAβ1～42濃度至30μmol/L，對腫瘤細胞的增殖抑制作用與20μmol/L劑量組無統計學差異(P＞0.05)。見圖1，圖2。

2.2 AO/EB雙染 陰性對照組無明顯凋亡細胞(圖3A)。實驗組可見早期凋亡細胞，表現為細胞核為AO染色呈黃綠色熒光，濃聚成新月形或顆粒狀，位于細胞一側(圖3B)。隨著rhAβ1～42作用濃度的增大和時間延長，早期凋亡細胞數量增加，晚期凋亡細胞也增多，后者表現為細胞核EB染色呈橘紅色，濃聚和偏向(圖3C)。細胞壞死時，細胞體積增大，呈不均勻的紅色熒光，輪廓不清(圖3D)。神經膠質瘤細胞隨給藥濃度的增大和時間的延長，細胞凋亡、死亡比例增加，細胞凋亡、壞死與rhAβ1～42的作用具有濃度和時間相關效應。

2.3 Western印跡檢測結果 不同濃度的rhAβ1～42作用U251細胞后，Bax蛋白的表達顯著升高，其效應具有濃度梯度依賴性，而Bcl-2蛋白表達呈下調趨勢。見圖4。

2.4 透射電鏡觀察 陰性對照組的細胞表面有微絨毛，核大，內質網、線粒體和高爾基體等結構清晰可見(圖5A);實驗組細胞核移位、染色質凝聚、細胞空泡化，核膜核仁完整性破壞，核膜破損(圖5B、圖5C)。

圖1 MTT法檢測不同濃度rhAβ1～42對U251細胞增殖影響的OD值

圖2 不同濃度rhAβ1～42對U251細胞的增殖抑制率

圖3 AO/EB雙染法觀察U251細胞凋亡形態學改變(×200)

圖4 Western印跡檢測凋亡蛋白Bax、Bcl-2的表達

圖5 透射電鏡觀察應用rhAβ1～42后U251細胞超微結構的改變(×7 500)

3 討論

Aβ在正常神經細胞和非神經細胞中不斷地分泌，并向細胞外釋放，進入腦背液〔1〕。Aβ 的肽鏈長短不同，Aβ1～42更易于形成斑塊樣沉積，而Aβ1～40則更傾向于形成典型的纖維。所以，Aβ1～42是構成老年斑的核心，而 Aβ1～40主要起到延長纖維的作用〔2〕。斑塊的形成過程首先是Aβ1～42分子間聚集形成淀粉樣斑塊的核心，由于 Aβ1～40和 Aβ1～42不斷地加入、聚集使核心擴大。由于沉積的Aβ本身有神經毒性，會引起神經元變性甚至凋亡。神經元凋亡的機制一方面是通過半胱氨酸、天冬氨酸特異性蛋白酶起作用;另一方面是Aβ對凋亡基因部位有影響，Bcl-2蛋白家族在細胞內凋亡信號轉導中則起關鍵作用。抗凋亡的主要是Bcl-2和Bcl-xL，促進凋亡的是Bax和Bad。有學者研究發現，Aβ1～42能促進Bax的表達，加速腦內膠質細胞活性增高，神經元的凋亡，激發體內炎癥反應等，導致β-淀粉樣蛋白纖維周圍出現一系列病理損傷，最終形成老年斑〔3〕。電鏡下可以看到，老年斑的核心部分為淀粉樣沉積物，它是由6 nm的細絲成束排列，老年斑外圍為反應性星形膠質細胞、小膠質細胞和變性神經末梢，后者主要是突觸前結構，其直徑為正常神經末梢的5～10倍，內部含有大量圓形致密的小體，可能是變性線粒體等，其中可見呈放射狀排列的淀粉樣沉積物，這些淀粉樣沉積物在AD腦組織及腦膜的微小血管的管壁上，故稱為腦血管淀粉樣變性〔4〕。可見，Aβ沉積在血管壁成為腦血管淀粉樣變性，沉積在大腦實質成為老年斑。

U251細胞屬于神經膠質瘤細胞，與神經元有一定的相似之處〔5〕，廣泛應用于研究離子通道、受體、遞質分泌的實驗中，也是研究神經毒性常用的細胞株。本研究表明，在0.5～20μmol/L的濃度內，rhAβ1～42對U251細胞的生長抑制率明顯上升，細胞毒性作用顯著增強，說明rhAβ1～42對U251細胞的生長抑制作用存在一定的量效依賴關系。

細胞凋亡是機體對有害因素引起損害的自衛反應。Aβ誘導凋亡的研究主要集中在揭示具體的凋亡信號通路。Yao等〔6〕認為，Aβ首先激活c-Jun氨基末端激酶(JNK)，引起抗凋亡基因Bcl-w表達減少以及線粒體促凋亡蛋白Smac的釋放，繼而引起細胞凋亡。抑制JNK的表達可有效阻止Aβ引起的細胞凋亡。Hsu等〔7〕發現，Aβ 能夠通過 PP-A-ASK1-p38MAPK-p53-Bax途徑誘導大腦內皮細胞凋亡。Aβ首先激活蛋白磷酸酶 (PP)-A，PP-A再激活ASK1，ASK1再激活p38MAPK，后者又激活了p53和Bax的表達。核因子(NF)-κB，作為一個可誘導形式定位于細胞質內，可被AGEs激活。研究顯示Aβ呈現兩期效應，低劑量時激活NF-κB，在神經元中作為重要的抗凋亡因子，對神經元起保護作用;而高劑量則下調NF-κB的活性，誘導細胞凋亡，在對 Aβ具有抗性的細胞內均有基本的 NF-κB活性表達〔8〕。在AD 中，NF-κB 活性明顯下調，同時伴隨著進行性死亡。

本實驗中，采用AO、EB兩種熒光染料雙染色，AO能透過完整細胞膜，嵌入細胞核DNA中(包括正常細胞和早期凋亡細胞)，使之發出亮綠色熒光;EB只能透過膜受損的細胞，嵌入核DNA(包括晚期凋亡細胞和壞死細胞)，發橘紅色熒光，可見濃縮的DNA碎片或凋亡小體。因此，正常細胞、早期凋亡細胞、晚期凋亡細胞、死亡細胞之間的區別主要是通過細胞核形態學變化來判斷的。凋亡細胞核呈現為染色增強，均勻一致的圓珠狀或固縮狀、團塊狀結構，在有的細胞中還可見到膜包裹的核碎片及細胞器形成的凋亡小體，芽生突出細胞表面;非凋亡細胞核呈現熒光深淺不一的結構樣特征，二者形態迥異，用這種方法可了解rhAβ1～42誘導肝細胞凋亡的形態學改變。

Bcl-2蛋白發揮線粒體膜通透性的抑制效應機制可能因其抑制細胞內Ca2+的重新分布，阻斷某些因素的促凋亡過程;參與細胞色素C的釋放;作為一種抗氧化劑，阻斷氧化作用對細胞組分的破壞;與線粒體ATP產量正相關〔9～11〕。本實驗結果中Bcl-2/Bax的表達特點說明rhAβ1～42對U251細胞誘導凋亡的機制可能與線粒體凋亡路徑的調控有關。筆者認為，Aβ1～42對U251細胞的損傷主要是通過凋亡途徑，對其生長具有明顯的抑制作用，其抑制作用可能是通過神經干細胞凋亡實現的。

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2 Wirths O，Multhaup G，Bayer TA.A modified beta-amyloid hypothesis:in-traneuronal accumulation of the beta-amyloid peptide-the first step of a fatal cascade〔J〕．JNeurochem，2004;91(3):513-20.

3 Wiley JC，Hudson M，Kanning KC，et al.Familial Alzheimer's disease mutations inhibit gamma-secretase-mediated liberation of beta-amyloid precursor protein carboxy-terminal fragment〔J〕．J Neurochem，2005;94(5):1189-201.

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6 Yao M，Nguyen TV，Pike CJ.Beta-amyloid-induced neuronal apoptosis involves c-Jun N-terminal kinase-dependent downregulation of Bcl-w〔J〕．J Neurosci，2005;25(5):1149-58.

7 Hsu MJ，Hsu CY，Chen BC，et al.Apoptosis signal-regulating kinase 1 in amyloid beta peptide-induced cerebral endothelial cell apoptosis〔J〕．J Neurosci，2007;27(21):5719-29.

8 Kaltschmidt B，Uherek M，Wellmann H，et al.Inhibition of NF-kappa B potentiates amyloid beta-mediated neuronal apoptosis〔J〕．Proc Natl Acad Sci USA，1999;96:9409-14.

9 Moriishi K，Koura M，Matsuura Y.Induction of Bad-mediated apoptosis by Sindbis virus infection:involvement of pro-survival members of the Bcl-2 family〔J〕．Virology，2002;292(2):258-71.

10 Kroemer G，Zamzami N，Susin SA.Mitochondrial control of apoptosis〔J〕．Immunol Today，1997;18(1):44-51.

11 Yang E，Korsmeyer SJ.Molecular thanatopsis:a discuss on the BCL2 family and cell death〔J〕．Blood，1996;88(2):386-401.