腫瘤壞死因子-α對大鼠離體灌注腎血管收縮的影響

郭蓮怡 金旭鵬 王桂君 李曉飛 牛 威 (遼寧醫學院附屬第一醫院消化科，遼寧 錦州 200)

終末期肝硬化和重型肝炎常并發多臟器衰竭，尤其是肝腎綜合征(HRS)時，患者預后極差。目前認為HRS的發生是腎血管收縮、腎臟低灌注所致，其機制尚不完全清楚。腫瘤壞死因子(TNF)-α作為重癥肝炎發生的重要因子〔1〕，與重癥感染時腎衰竭的發生發展明顯相關〔2〕。本研究觀察TNF-α對離體大鼠腎血管收縮的影響及機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選擇清潔級雄性SD大鼠56只，重約250～300 g。由遼寧醫學院實驗動物中心提供，許可證號:SCXK(遼)2003-0007，開放系統飼養，實驗前禁食12 h。

1.2 主要試劑和儀器 TNF-α、內皮素(ET)-1(Sigma公司)、Verapamil(上海德默生物科技有限公司)、2-氨基乙基二苯硼酸鹽(2-APB，Sigma公司)、Kreb灌流液、無鈣 Kreb灌流液。minipuls2灌注泵，法國Gilson;RM6000多導生理記錄儀，日本;恒溫灌注池，廣東;Oxnard CA張力換能器，美國Gould;氧合器，熱交換器、HTG恒溫器，上海;倒置顯微鏡，德國Carl Zeiss公司。

1.3 離體灌注腎實驗模型的建立〔3〕戊巴比妥鈉(30 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠。剪毛，消毒，腹壁正中切開，分離腸系膜上動脈及右腎動脈。腸系膜上動脈插管至右腎動脈，三通接灌注裝置和張力換能器，開放腎靜脈。取出左腎稱重作為對照腎重。灌注過程:啟動灌注泵灌流，流量為5 ml/min，溫度為37℃，并給予95%氧和5%二氧化碳。

1.4 實驗分組 56只大鼠制備離體灌注腎模型后隨機分為8組(n=7):①A1組:Kreb液灌流;②A2組:含TNF-α(100μg/L)的Kreb液灌流;③B1組:含Verapamil(0.1 mmol/L)的Kreb液灌流;④B2組:含 Verapamil(0.1 mmol/L)及 TNF-α(100 μg/L)的Kreb液灌流;⑤C1組:無鈣Kreb液灌流;⑥C2組:含TNF-α(100μg/L)的無鈣Kreb液灌流;⑦D1組:含2-APB(50μmol/L)的無鈣Kreb液灌流;⑧D2組:含2-APB(50μmol/L)及 TNF-α(100μg/L)的無鈣Kreb液灌流。

1.5 離體腎體外灌注過程 分三期:平衡期:各組在灌流通路上，均先用有鈣或無鈣Kreb液灌流30 min達平衡;灌流期:用含特定成分的有鈣或無鈣Kreb液灌流90 min;刺激期:各組均予含ET(1 nmol/L)的有鈣或無鈣Kreb液繼續灌流20 min。

1.6 腎臟水腫率及病理檢查 灌流結束后，各組腎標本稱重，計算腎臟水腫率，腎臟水腫率=(灌流后腎重-對照腎重)/對照腎重。4%多聚甲醛固定，石蠟包埋、常規HE染色，光鏡下觀察腎小球及腎小管形態、結構。

1.7 統計學方法 采用SPSS17.0軟件進行t檢驗。

2 結果

2.1 TNF-α對基礎灌注壓的影響 平衡期過后，各組基礎灌注壓比較無顯著差異(P＞0.05)。TNF-α、2-APB預灌流時，基礎灌注壓無明顯改變。

2.2 TNF-α對腎血管收縮作用的影響 A1、A2組ET刺激后，灌注壓較基礎壓均明顯升高(P＜0.05);A2組灌注壓升高值顯著高于A1組(P＜0.01)。見圖1，表1。B1、B2組ET刺激后，灌注壓較基礎壓均明顯升高(P＜0.05);B2組灌注壓升高值顯著高于B1組(P＜0.01)。見圖2，表1。C1、C2組ET刺激后，灌注壓較基礎壓均明顯升高(P＜0.05);C2組灌注壓升高值顯著高于C1組(P＜0.01)。見圖3，表1。D1、D2組ET刺激后，腎灌注壓均略升高，但與基礎灌注壓比較無顯著差異(P＞0.05);兩組灌注壓升高值比較無顯著性差異(P＞0.05)。見圖4，表 1。

表1 各組大鼠離體腎灌注壓結果(x ± s，n=7)

圖1 A1、A2組腎血管灌注壓的變化

圖2 B1、B2組腎血管灌注壓的變化

圖3 C1、C2組腎血管灌注壓的變化

圖4 D1、D2組腎血管灌注壓的變化

2.3 腎臟水腫率及病理變化 A1、A2、B1、B2、C1、C2、D1、D2組腎臟的水腫率分別為(28±2)%、(29±30)%、(28±3)%、(27±2)%、(26±3)%、(27±3)%、(29±30)%、(26±2)%，灌流后腎組織無明顯器質性損傷，與灌流前相符。見圖5。

圖5 灌流前后腎組織HE染色(×200)

3 討論

當HRS發生時，患者血清中許多縮血管活性物質水平明顯增高，并可通過直接或間接途徑引起腎血管收縮，是導致腎血流灌注和腎功能紊亂的重要介質〔4〕。近年來學者們認為:重型肝炎患者體內TNF-α濃度明顯增高，是導致多臟器衰竭的重要因子，研究表明TNF-α能夠通過多種途徑引起血管收縮，參與相關疾病的病理生理過程:① TNF-α可通過TNFR2和ETETR依賴途徑引起血管收縮。當阻斷ETA、ETB受體后，TNF-α就不再有縮血管作用了〔5〕。② TNF-α抑制內皮依賴的一氧化氮-環磷酸鳥苷(NO-CGMP)途徑導致血管收縮。TNF-α可活化蛋白激酶C(PKC)從而抑制內皮型一氧化氮合酶(eNOS)磷酸化;同時TNF-α可通過縮短eNOSmRNA的半衰期來下調eNOS mRNA〔6〕。③ TNF-α能夠增強Ca2+依賴及非 Ca2+依賴蛋白激酶活性，從而增強血管平滑肌細胞收縮〔7〕。

本實驗建立離體灌注腎模型，應用多導生理記錄儀檢測腎灌注壓發現:腎臟經含TNF-α的Kreb液灌流后，其腎血管對ET的反應提高，表現為腎血管灌注壓明顯高于非TNF-α處理組。結果表明:TNF-α可增強ET的腎血管收縮作用。而Kreb液所含鈣離子可通過平滑肌細胞膜上的鈣通道進入胞內，從而引起腎血管灌注壓增高，為排除這一因素，應用Verapamil阻斷膜上的鈣通道后，予含TNF-α的Kreb液灌流，其腎血管對ET的反應仍增高，腎血管灌注壓仍高于非TNF-α處理組。進一步應用含TNF-α的無鈣Kreb液灌流腎臟后，其腎血管對ET的反應提高，腎血管灌注壓明顯高于非TNF-α處理組，表明TNF-α通過增強ET引起的胞內鈣釋放促進腎血管收縮。

1，4，5三磷酸肌醇(IP3)是細胞間跨膜信息傳遞的第二信使，IP3受體(IP3R)為離子通道受體，主要分布在內質網、肌漿網上，其末端有IP3結合點。一旦IP3與IP3R結合，IP3R構象則發生改變，導致通道開放，內質網中的儲備鈣被釋放到胞質中，以調節各種細胞的生物活性〔8〕。已知ET等血管活性物質與靶細胞膜上特異性受體(如ET受體)結合后，使膜磷脂酰肌醇4，5-二磷酸發生磷酸化生成 IP3，IP3與IP3R(胞內主要的Ca2+釋放通道)結合則促進細胞內Ca2+釋放，使胞內Ca2+水平增高〔9〕，引起細胞收縮。2-APB是一種常用的IP3R的阻斷劑，可特異性阻斷IP3R〔10〕，本實驗應用含2-APB及TNF-α的無鈣Kreb液灌流腎臟，其腎血管對ET的反應較差，ET刺激后的腎血管灌注壓無顯著變化。結果表明:2-APB可阻斷TNF-α的前述作用，說明TNF-α可能通過上調IP3R進而增強ET引起的腎血管收縮。已有報道:TNF-α可誘導腎小球纖維蛋白沉積、中性粒細胞浸潤、細胞凋亡，引起腎小球濾過率下降。因此實驗結束后，所有的腎臟標本稱重，計算其水腫率低于30%，說明灌流成功;并進行常規病理檢查均未發現腎小管及腎小球細胞病理性改變，故排除了實驗結果受器質性腎臟損傷影響的因素〔11〕。

綜上所述，重癥肝炎患者血中存在的高濃度TNF-α可能上調IP3R，促進胞內鈣釋放，增強腎血管對ET的收縮敏感性，造成腎臟低灌注，參與HRS發生。

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