不同月齡大鼠陰莖海綿體內硫化氫含量與勃起功能的相關性

遲寶進 杜從林 李淑奎 桂士良 白海濤 羅振國 張天宇

(佳木斯大學附屬第一醫院泌尿外科，黑龍江 佳木斯 154002)

增齡已被公認為是勃起功能障礙(ED)的高危因素〔1〕。在陰莖勃起方面以往主要關注于一氧化氮(NO)和氧化碳(CO)，隨著對勃起生理機制的深入研究發現硫化氫(H2S)在勃起過程中也起著重要的作用，H2S可以促使陰莖勃起功能改善且可增加陰莖海綿體內NO合酶(NOS)含量〔2〕，另外Srilethine等〔3〕研究發現H2S類似于NO及CO具有舒張陰莖海綿體血管最終促使陰莖勃起作用。目前研究大多是檢測血液H2S含量與勃起功能的關系，本實驗旨在探討大鼠增齡對陰莖海綿體內H2S含量影響及其與陰莖勃起功能的相關性。

1 材料與方法

1.1 研究對象及分組 于佳木斯大學動物實驗中心隨機選取2、8、16及24月齡健康雄性Wistar大鼠各10只，同一組大鼠體重相近，相差30 g以內;根據月齡分為A、B、C、D組。依次對每只老鼠用記號筆編號標記，四組置于同一實驗室的相同環境中，溫度為(22±2)℃，濕度為(65±5)%，均給予相同的普通飼料和飲水喂養4 w。

1.2 主要儀器及試劑 阿撲嗎啡(APO)產自美國Sigma公司，紫外分光光度計購自上海光學儀器廠，多導生理信號采集處理系統產自成都泰盟科技有限公司。

1.3 大鼠勃起次數測定 整個實驗過程在安靜環境中進行，用100μg/kg的阿樸嗎啡分別在每只大鼠頸項部進行皮下注射，然后持續觀察60 min，出現龜頭充血并陰莖變長則為1次陰莖勃起，記錄每只大鼠的陰莖勃起次數。

1.4 大鼠海綿體壓力測定 4 w后，各組進行海綿體壓力測定。戊巴比妥鈉(1%，50 mg/kg)以腹腔注射方式麻醉大鼠，麻醉滿意后行左側頸總動脈插管并記錄平均動脈壓(MAP)，而后顯露陰莖海綿體，將充滿肝素的22 G針頭一端插入左側陰莖海綿體并且另一端與PE50管連接后與壓力換能器相連，注意排盡管道內空氣，用以測定陰莖海綿體內壓(ICP)。沿前列腺表面的外后部分尋找盆神經節，將其作為電刺激部位。ICP-max/MAP的變化用RM6240型多導生理信號采集處理系統來記錄，待ICP和MAP數據波動穩定后，給予相應參數的電刺激，電刺激參數為:0 V、5 V，2 ms，25 Hz，連續單刺激，持續1 min，停止5 min后可重復給予電刺激，本實驗于第1、7分鐘分別記錄0 V和5 V電刺激下ICPmax/MAP的變化。

1.5 血漿H2S濃度測定 測海綿體壓力前1 d采用劃破眼眶后靜脈的方法采血2 ml，經離心、沉淀后取100μl上清液并加入盛有250μl的1%醋酸鋅和0.4 ml蒸餾水的 EP管中，加入133μl的20 mmol/L對苯二銨鹽酸鹽及133μl的30 mmol/L三氯化鐵。常溫孵育10 min，加入250μl的10% 三氯醋酸，4℃下17 500 r/min離心10 min，取上清液于孔板中在670 nm波長測吸光度，配制 NaHS 標準曲線〔4～6〕。

1.6 陰莖海綿體組織內H2S含量及生成率測定 海綿體測壓后處死大鼠并分離出左右陰莖海綿體并用PBS洗脫血液，將大鼠陰莖海綿體組織與 PBS(0.10 mol/L，pH7.4)按照1∶10勻漿，取0.5 ml勻漿加入10 mmol/L的L-半胱氨酸20μl，生理鹽水30 μl和2 mmol/L 5-磷酸吡哆醛 20 μl，在溫水(37℃)中反應30 min;在上述反應體系中加入1%(W/V)的乙酸鋅250μl及10%(W/V)的三氯乙酸250μl，37℃水浴60 min終止反應;加入133μl、20 mmol/L對苯二銨鹽酸鹽和133μl 30 mmol/L三氯化鐵，20 min后以670 nm 波長測吸光度〔4～6〕。

1.7 統計學分析 采用SPSS17.0軟件進行多組獨立樣本t檢驗及線性相關性分析。

2 結果

2.1 各組勃起功能評價 隨著月齡增長，大鼠陰莖勃起次數逐步減少。各組0 V和5 V電刺激下ICPmax/MAP平均比值兩兩比較均具有顯著性差異(P＜0.05)，見表1。

表1 各組平均陰莖勃起次數和ICPmax/MAP比較(x ± s，n=10)

2.2 各組血漿、陰莖海綿體內H2S含量及生成率比較 隨著月齡的增長，血漿、陰莖海綿體內H2S的含量和生成率均逐漸降低，兩兩比較均有顯著性差異(P＜0.05)，見表2。

表2 各組血漿、陰莖海綿體H 2S含量及生成率比較(x ± s，n=10)

2.3 H2S的含量與勃起功能的相關性 各組陰莖海綿體內H2S含量與相應的ICPmax/MAP(0 V、5 V)值均呈正相關，見表3。

表3 各組陰莖海綿體內H 2 S含量與ICPmax/MAP(0 V、5 V)值的相關性分析

3 討論

20～30歲男性ED概率為3%，而60歲以上約有70%男性存在ED〔7〕。APO是通過中樞調節而發生作用〔8〕，本實驗表明增齡大鼠的中樞調節勃起功能的機制減弱。另外增齡勃起功能下降的原因可能有血管和陰莖海綿體平滑肌舒縮功能的減退，性激素分泌水平與活性的降低，自主神經系統神經末梢釋放神經介質功能的衰退等〔9〕。

陰莖勃起宏觀上講是復雜的神經血管過程，微觀研究發現有多種活性因子及信號分子在此過程中起調控作用〔10〕。目前已知參與陰莖勃起功能調節的氣體分子遞質主要為CO、NO、H2S，其中NO和CO共同作用于鳥苷酸環化酶，后者使GTP轉變為cGMP，cGMP濃度增高，致使其調節Ca2+濃度能力增強，血管平滑肌舒張能力提高而致陰莖勃起，隨著年齡增長大鼠陰莖海綿體內CO和NO含量均減少，參與老年ED的發生，而H2S在勃起功能中的調節機制有別于二者。H2S可通過ATP敏感的K+通道(KATP)途徑作用于血管平滑肌細胞，雖然具體作用機制未完全明確，但已有研究結果表明，在不需要第2信號分子參與的情況下H2S可直接增強KATP通道的電流使細胞膜超極化來發揮其松弛主動脈的調節作用〔11〕。K+通道調控在膜電位和平滑肌細胞張力水平調節中起著關鍵性作用，陰莖勃起過程中細胞上開放的K+通道數量增多使得K+外流增多，導致膜電位超極化，引起開放的L型電壓依賴性Ca2+通道減少，內流的Ca2+減少，平滑肌舒張〔12〕。另外H2S還可與睪酮、NO、CO以協同作用等方式來舒張陰莖海綿體血管平滑肌。

本實驗反映陰莖海綿體組織內總體H2S含量隨著增齡而減少，產生H2S能力亦逐漸衰退。老齡性ED病因之一可能是陰莖海綿體組織總體H2S含量降低，導致平滑肌細胞膜上K+通道開放減少，外流K+減少;另亦減弱H2S對NO、CO的協同作用，從而最終使陰莖海綿體血管平滑肌舒張能力下降。

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2 遲寶進，羅振國，秦文波，等.硫化氫對老年大鼠陰莖海綿體平滑肌細胞內一氧化氮合酶含量的影響〔J〕.中國老年學雜志，2014;34(11):3047-9.

3 Srilethine B，Adaikan PG，Moore PK.Possible role for the novel gasotransmitter hydrogen sulfide in erectile dysfunction:a pilot study〔J〕.Eur J Pharmacol，2006;535:280-2.

4 Srilatha B，Muthulakshmi P，Adaikan PG，et al.Endogenous hydrogen sulfide insufficiency as a predictor of sexual dysfunction in aging rats〔J〕.Aging Male，2012;15(3):153-8.

5 Aminzadeh MA，Vaziri ND.Downregulation of the renal and hepatic hydrogen sulfide(H2S)-producing enzymes and capacity in chronic kidney disease〔J〕.Nephrol Dial Transplant，2012;27(2):498-504.

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8 李付彪，宋志宇，張家穎，等.增齡對大鼠陰莖勃起功能的影響〔J〕.中國老年學雜志，2003;23(10):290-2.

9 何麗娟，張 晨，李文玉，等.不同月齡大鼠勃起功能狀況的實驗研究〔J〕.中華男科學雜志，2013;19(4):296-9.

10 楊丕堅，呂以培，李舒敏，等.糖尿病性勃起功能障礙與血管內皮功能的相 關性〔J〕.中國老年學雜志，2012;32(22):5072-3.

11 Zhao W，Zhang J，Lu Y，et al.The vasorelaxant effect of H2Sas a novel endogenous gaseous K(ATP)channel opener〔J〕.EMBO J，2001;20:6008-16.

12 劉本春，林桂亭，辛鐘成.陰莖海綿體平滑肌收縮的分子機理研究進展〔J〕.中國男科學雜志，2006;20(9):52-3.