基于文獻(xiàn)挖掘的中醫(yī)證候生物學(xué)基礎(chǔ)初步研究

劉婧瑋 翟興 馮玄超 高闊 趙慧輝 陳坤 劉甲 陳建新

摘要：目的 以中醫(yī)常見證型氣虛證為切入點(diǎn)，從生物分子網(wǎng)絡(luò)角度探索中醫(yī)證候生物學(xué)基礎(chǔ)。方法 建立神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫（NEI）相關(guān)基因數(shù)據(jù)字典及氣虛證表征術(shù)語詞庫(kù)，并通過Genclip軟件檢索氣虛證表征文獻(xiàn)并挖掘氣虛證特征性NEI基因，探索證候的生物活性物質(zhì)。結(jié)果 對(duì)挖掘出的基因數(shù)據(jù)進(jìn)行分析顯示，“氣虛證”相關(guān)基因與內(nèi)分泌、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、造血細(xì)胞系、免疫缺陷等相關(guān)。中醫(yī)證型的內(nèi)在生物學(xué)特征可以在NEI水平上進(jìn)行有效的辨識(shí)。結(jié)論 文獻(xiàn)挖掘作為一種新的發(fā)現(xiàn)證候生物學(xué)指標(biāo)的方法具有一定的可行性，建議將其擴(kuò)大到其他證型的研究中，驗(yàn)證該方法的普適性和可靠性。

關(guān)鍵詞：中醫(yī)證候；氣虛證；文獻(xiàn)挖掘；生物學(xué)基礎(chǔ)；神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2015.07.013

中圖分類號(hào)：R2-05 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2015）07-0043-04

中醫(yī)學(xué)的基本特點(diǎn)在于整體觀和辨證論治，以病證結(jié)合、方證相應(yīng)，即“病證方”結(jié)合的診療模式為特色。證（證候）的生物學(xué)基礎(chǔ)則是中醫(yī)藥現(xiàn)代化的關(guān)鍵，目前研究較多的有血瘀證、腎陽虛證、寒證、熱證等，并形成了證本質(zhì)研究、證實(shí)質(zhì)研究、證候客觀化等多個(gè)學(xué)術(shù)生長(zhǎng)點(diǎn)，如陰黃證和陽黃證的代謝組學(xué)發(fā)病機(jī)制[1]，為闡釋中醫(yī)證候的生物學(xué)本質(zhì)，證的診斷客觀化、規(guī)范化和病證分型治療提供依據(jù)。

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（81173463）；北京市青年英才計(jì)劃（YETP0821）

通訊作者：陳建新，E-mail：Cjx@bucm.edu.cn

氣虛證是中醫(yī)常見證型，可見于研究深入的幾大疾病中，如冠心病、心力衰竭、糖尿病等[2-7]，臨床常見檢驗(yàn)方法已對(duì)上述疾病進(jìn)行診斷。研究表明，這些常見病與神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫（NEI）密切相關(guān)[8]。本研究以NEI網(wǎng)絡(luò)相關(guān)基因?yàn)榛A(chǔ)，以氣虛證為切入點(diǎn)，通過文獻(xiàn)挖掘方法初步得到了氣虛證基于NEI網(wǎng)絡(luò)特有的生物活性物質(zhì)，對(duì)闡明證候的客觀性，揭示證候、疾病中分子相互作用機(jī)制有著重要意義，為揭示證候的科學(xué)內(nèi)涵奠定了方法學(xué)基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 收集表征術(shù)語關(guān)鍵詞

以中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《中醫(yī)臨床診療術(shù)語》為主要依據(jù)收集、整理出11個(gè)“氣虛證”的表征術(shù)語關(guān)鍵詞，包括氣虛、隱痛、鈍痛、氣短、乏力、神疲、懶言、頭暈、自汗、舌淡、脈虛。

1.2 文獻(xiàn)挖掘方法

從dbNEI（http：//166.111.130.62/portal/root/ bi_dbnei/download.jsp）數(shù)據(jù)庫(kù)上下載NEI相關(guān)基因（共2242個(gè)與NEI相關(guān)的基因），載入Genclip軟件中，然后使用該軟件的“Word related Gene Search”功能在文獻(xiàn)庫(kù)中挖掘與給定表征術(shù)語相關(guān)的NEI基因，并使用“Literature Mining Gene Networks”功能構(gòu)建氣虛證每個(gè)表征術(shù)語的基因網(wǎng)絡(luò)。分別比較挖掘出的與氣虛證各關(guān)鍵詞相關(guān)的基因，找出同時(shí)出現(xiàn)在2個(gè)關(guān)鍵詞及以上的那些基因，由于這些基因至少同時(shí)在某一證候的2種表征中出現(xiàn)，那么，他們就很可能與該證候有一定聯(lián)系而非只和單一表征有關(guān)，即與氣虛證有聯(lián)系。

1.3 基因分析方法

應(yīng)用DAVID Bioinformatics Resources 6.7軟件[9]對(duì)所得基因進(jìn)行分層聚類、基因類型測(cè)試和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）通路分析。基因聚類測(cè)試是一種探索性的工具，用以探索檢測(cè)基因表達(dá)數(shù)據(jù)內(nèi)部的關(guān)聯(lián)性，為進(jìn)一步考慮進(jìn)行假設(shè)性的篩選。KEGG通路分析可以幫助尋找所提供基因所參與的生物過程。

2 結(jié)果

文獻(xiàn)挖掘結(jié)果顯示，氣虛的11個(gè)關(guān)鍵詞中有5個(gè)挖掘出與之相關(guān)的基因，具體關(guān)鍵詞及挖掘出的基因個(gè)數(shù)見表1；通過比較氣虛證與各個(gè)關(guān)鍵詞相關(guān)的基因，找出了15個(gè)同時(shí)出現(xiàn)在2個(gè)關(guān)鍵詞及以上的基因，見表2。脈虛、自汗、頭暈、氣虛關(guān)鍵詞基因網(wǎng)絡(luò)見圖1。

表1 氣虛證關(guān)鍵詞對(duì)應(yīng)的基因數(shù)目

關(guān)鍵詞 基因個(gè)數(shù)

氣虛 21

呼吸困難 95

頭暈 63

脈虛 4

自汗 4

表2 同時(shí)出現(xiàn)在2個(gè)表征術(shù)語及以上的基因

編號(hào) 氣虛基因 出現(xiàn)次數(shù)

1 IL6（白細(xì)胞介素6） 4

2 IL10（白細(xì)胞介素10） 4

3 IL2（白細(xì)胞介素2） 3

4 IL1B（白細(xì)胞介素β） 3

續(xù)表2

編號(hào) 氣虛基因 出現(xiàn)次數(shù)

5 IFNG（干擾素γ） 3

6 POMC（阿黑皮素） 3

7 ADIPOQ（脂聯(lián)素） 3

8 IL8（白細(xì)胞介素8） 3

9 IL5（白細(xì)胞介素5） 2

10 CD14（細(xì)胞表面分化抗原14） 2

11 CD79A（細(xì)胞表面分化抗原79-α） 2

12 FGF2（成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子） 2

13 CD40LG（細(xì)胞表面分化抗原40配體） 2

14 NPPB（腦鈉肽） 2

15 LEP（人瘦素） 2

脈虛 自汗

氣虛

頭暈

圖1 氣虛證關(guān)鍵詞基因網(wǎng)絡(luò)

3 討論

1973年，Isakovi?[10]和Jankovi?[11]通過雙邊對(duì)稱電解損傷大鼠大腦不同部位（下丘腦、腦干網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)、丘腦、上丘、尾狀核和杏仁復(fù)合體），并觀察其對(duì)淋巴器官的影響后，首次提出了NEI三大系統(tǒng)之間的關(guān)系。NEI網(wǎng)絡(luò)學(xué)說的提出和發(fā)展，與幾千年來中醫(yī)理論提倡的整體觀念可謂不謀而合，并在一定程度上為來源于長(zhǎng)期臨床實(shí)踐的中醫(yī)理論提供了現(xiàn)代醫(yī)學(xué)證據(jù)。1990年，高氏[12]和王氏[13]將NEI網(wǎng)絡(luò)與中醫(yī)理論相聯(lián)系，并引起了中醫(yī)界的廣泛關(guān)注。因此，我們認(rèn)為借助NEI網(wǎng)絡(luò)，可以更好地理解中醫(yī)，進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)中醫(yī)的現(xiàn)代化與國(guó)際化。

網(wǎng)絡(luò)是復(fù)雜生物系統(tǒng)的表現(xiàn)方式，網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜性本質(zhì)上就是“關(guān)系”的復(fù)雜性。正是系統(tǒng)生物學(xué)以上研究模式與策略的變革與進(jìn)步，使從生物分子網(wǎng)絡(luò)角度探索證候的生物學(xué)基礎(chǔ)具備了現(xiàn)實(shí)可行性。中醫(yī)藥現(xiàn)代研究中，不少學(xué)者曾對(duì)NEI網(wǎng)絡(luò)、分子網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)和細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)等問題進(jìn)行了思考[14-16]，提示中醫(yī)藥現(xiàn)代研究需突破單生物學(xué)指標(biāo)的局限，充分考慮機(jī)體內(nèi)部復(fù)雜的相互聯(lián)系，強(qiáng)調(diào)了中醫(yī)藥現(xiàn)代研究突破“還原論”的重要性。然而，由于“系統(tǒng)”相關(guān)的數(shù)據(jù)尚未完善，以及建模、仿真和分析等“計(jì)算”能力的缺乏，既往的“網(wǎng)絡(luò)”往往局限于現(xiàn)象描述，側(cè)重于理論與概念分析。近年來，“系統(tǒng)生物學(xué)”的新興，海量數(shù)據(jù)獲取技術(shù)（如“組學(xué)”），尤其是計(jì)算分析能力和系統(tǒng)建模等方法的迅速發(fā)展，給“生物網(wǎng)絡(luò)”賦予了豐富的、實(shí)質(zhì)性的內(nèi)涵，并迅速成為國(guó)際生命科學(xué)與醫(yī)學(xué)研究的新熱點(diǎn)。多學(xué)科專家開始致力于從海量數(shù)據(jù)中尋找實(shí)現(xiàn)生命功能或?qū)е录膊〉膬?nèi)在網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，了解其時(shí)空變化及系統(tǒng)性質(zhì)，并發(fā)展控制措施。例如，2005年提出了“網(wǎng)絡(luò)生物學(xué)”[17]，同年《Cell》首次刊登了人類的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)[18]。系統(tǒng)生物學(xué)以建立可預(yù)測(cè)、可預(yù)防和個(gè)體化的新的醫(yī)學(xué)診療體系為目的[19]，其中基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)、蛋白質(zhì)/蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)及代謝網(wǎng)絡(luò)等生物網(wǎng)絡(luò)的研究則是理解“系統(tǒng)”的關(guān)鍵。與此同時(shí)，計(jì)算與實(shí)驗(yàn)相交融的系統(tǒng)生物學(xué)研究策略和生物信息學(xué)方法，在生物網(wǎng)絡(luò)的研究中正發(fā)揮著越來越重要的作用，成為生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)研究從“還原論”走向“系統(tǒng)論”及從“描述性”轉(zhuǎn)為“預(yù)測(cè)性”的一個(gè)重要標(biāo)志。

Genclip是一種文獻(xiàn)挖掘軟件，可對(duì)基因芯片的差異表達(dá)基因進(jìn)行特定的功能聚類，以及構(gòu)建特定功能的基因網(wǎng)絡(luò)[20]。將每個(gè)基因?qū)胲浖粌H能顯示出該基因諸多的名稱，也能給出該基因的功能注釋和文獻(xiàn)摘要。使用者還可以根據(jù)自己的研究方向添加和組合關(guān)鍵詞，然后進(jìn)行基因與基因之間關(guān)系的挖掘，最后得出的是基于待分析基因和指定關(guān)鍵詞的信號(hào)通路（網(wǎng)絡(luò)）。該軟件利用的文獻(xiàn)是不斷更新的，所以挖掘的基因與關(guān)鍵詞的關(guān)系總是處于不斷更新中，挖掘出來的疾病機(jī)制也總是最新的。本研究從復(fù)雜生物網(wǎng)絡(luò)的角度切入，以中醫(yī)辨證的常見證型——?dú)馓撟C為例，通過挖掘與證候表征相關(guān)的基因而構(gòu)建證候的生物分子網(wǎng)絡(luò)，從不同角度進(jìn)行證候生物分子網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建的研究，通過分析、整合NEI的典型調(diào)控環(huán)節(jié)，以及激素、細(xì)胞因子、神經(jīng)遞質(zhì)的相互作用，探索氣虛證的生物學(xué)基礎(chǔ)。通過比較、分析文獻(xiàn)挖掘的數(shù)據(jù)，我們發(fā)現(xiàn)氣虛相關(guān)集群與內(nèi)分泌、信號(hào)傳導(dǎo)、造血細(xì)胞系、炎癥反應(yīng)等相關(guān)，從而表明本方案可以對(duì)中醫(yī)證型的內(nèi)在生物學(xué)特征進(jìn)行有效地辨識(shí)。

文獻(xiàn)挖掘作為一種即省時(shí)、省力又簡(jiǎn)單易行的挖掘證候生物學(xué)指標(biāo)的方法，也正在被越來越多的研究人員所采納。但作為一種新的挖掘證候生物學(xué)指標(biāo)的方法來說，本研究還存在一些不足，主要表現(xiàn)為研究“深度”和“廣度”不足兩個(gè)方面：“深度”方面，實(shí)驗(yàn)所采用的文獻(xiàn)挖掘方法挖掘出的基因的準(zhǔn)確性還未達(dá)到非常理想的程度，后期可以考慮引入更多的挖掘方法進(jìn)行對(duì)比分析，以提高挖掘的準(zhǔn)確度；而“廣度”方面，本研究?jī)H對(duì)氣虛證進(jìn)行了系統(tǒng)研究，下一步還需要擴(kuò)大到其他證型的研究中，從而進(jìn)一步驗(yàn)證該方法的普適性和可靠性。

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（收稿日期：2014-10-27）

（修回日期：2014-12-05；編輯：華強(qiáng)）