海南省芒果畸形病的發(fā)現(xiàn)與鑒定

張賀　韋運(yùn)謝　漆艷香　劉曉妹　謝藝賢　喻群芳　蒲金基

摘 要 從海南省東方市、三亞市采集芒果畸形病組織，運(yùn)用柯赫氏法則證實(shí)分離物為該病的致病菌。采用Fusarium mangiferae的特異性鑒別引物1-3F/R和AF1對(duì)致病菌進(jìn)行PCR鑒別，結(jié)合形態(tài)特征將其鑒定為F. mangiferae，這是芒果畸形病在海南省的首次報(bào)道。

關(guān)鍵詞 Fusarium mangiferae；芒果畸形病；海南省

中圖分類號(hào) S667.7 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Abstract Mango tissue samples infected by malformation disease were collected from Dongfang City and Sanya City， Hainan. Isolate MMD-30 was confirmed to be the pathogen of the disease through Koch's postulates. Based on species-specific PCR analysis with the primers 1-3 F/R and AF1 for Fusarium mangiferae， combined morphological identification， the isolate was confirmed to be F. mangiferae. This is the first discovery and identification of mango malformation disease caused by F. mangiferae in Hainan.

Key words Fusarium mangiferae；Mango malformation disease；Hainan

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2015.07.019

芒果（Mangifera indica L.）隸屬漆樹科芒果屬，是世界五大著名熱帶水果之一。中國(guó)芒果種植歷史悠久，是目前種植芒果87個(gè)國(guó)家之一，主要分布于臺(tái)灣、海南、廣西、廣東以及云南、四川、福建、貴州等熱帶、亞熱帶地區(qū)[1]。芒果在生長(zhǎng)過程受多種病害的危害，制約著芒果產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。芒果畸形病（Mango Malformation Disease，MMD）在世界范圍內(nèi)普遍發(fā)生危害，平均產(chǎn)量損失達(dá)50%～80%，嚴(yán)重時(shí)植株完全絕產(chǎn)[2]。芒果畸形病有多種病原菌，如Fusarium mangiferae，F(xiàn).sterilihyphosum，F(xiàn).proliferatum，F(xiàn).tupiense和F.mexicanum，其中以F. mangiferae為世界性廣泛分布的病原菌[3]，對(duì)芒果產(chǎn)業(yè)的威脅最大。為了更有效、更簡(jiǎn)便地對(duì)F. mangiferae進(jìn)行鑒定，Zheng和Ploetz[4]采用RAPD的方法獲得該菌的特異性片段，并在此基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)特異性引物1-3F/R，用于F. mangiferae的鑒定。Crespo等[5]應(yīng)用該引物成功地對(duì)西班牙阿薩爾基亞（Axarquia）地區(qū)的芒果畸形病進(jìn)行了鑒定。Newman等[6]利用AFLP技術(shù)獲得F. mangiferae的特異性片度，設(shè)計(jì)AF1、RD4等多條特異性鑒定引物用于病原菌的鑒定。芒果畸形病于1891年首次在印度比哈爾邦發(fā)現(xiàn)[7]，隨后在非洲、亞洲和美洲等芒果產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生[3]，國(guó)內(nèi)最早發(fā)生于云南元江西北灌渠，發(fā)病株率達(dá)75.4%[8]；隨后在金沙江干熱河谷地區(qū)爆發(fā)流行，病株率達(dá)30%～60%，有的甚至高達(dá)95%，危害日益嚴(yán)重[9]；2009年，周俊岸等[10]報(bào)道廣西亞熱帶作物研究所芒果園發(fā)現(xiàn)芒果畸形病。近年，筆者在海南省東方市及三亞市的部分果園發(fā)現(xiàn)疑似芒果畸形病癥狀樣品，病株嫩梢腋芽與頂芽叢生，節(jié)間明顯變短，葉片變窄、變厚而脆，最后干枯。尚未見有對(duì)海南省芒果畸形病的報(bào)道。因此，作者對(duì)采集病樣進(jìn)行分離鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料

典型芒果畸形病癥狀標(biāo)本（圖1），2013年11月采集自海南省東方市及2014年1月采集自海南省三亞市。參照文獻(xiàn)[11]分離病原菌后備用。

1.2 方法

1.2.1 致病性測(cè)定 接種材料為健康盆栽2年生臺(tái)農(nóng)1號(hào)芒幼苗。采用活體接種，將分離純化的菌株MMD-30在PD培養(yǎng)液[11]中振蕩培養(yǎng)6 d后，過濾除菌體，配置約1×106個(gè)/mL分生孢子懸浮液。在健康芒果苗腋芽下約3 cm處用微型注射器注射0.1 mL懸浮液，對(duì)照接等量無菌水，每處理重復(fù)3次，敷濕潤(rùn)海綿保濕培養(yǎng)。觀察記錄發(fā)病情況，與自然發(fā)病癥狀做對(duì)比。待接種腋芽發(fā)病后對(duì)病斑再次進(jìn)行組織分離、觀察其病原形態(tài)。

1.2.2 病原菌形態(tài)學(xué)鑒定 將純化后的病原菌接種到PDA培養(yǎng)基上，28 ℃黑暗培養(yǎng)5 d后，觀察菌落顏色和形狀，鏡檢分生孢子的形態(tài)、顏色，分別測(cè)量100個(gè)大分生孢子和小分生孢子大小。

1.2.3 病原菌的分子鑒定 參照OMEGA Fungal gDNA Kit說明書操作提取病原菌gDNA。參照鑒定芒果畸形病病原菌特異性引物對(duì)1-3F/R[4]（1-3F：5′-TGCAGATAATGAGGGTCTGC-3′和1-3R：5′-G

GAACATTGGGCAAAACTAC-3′）和Newman等[6]設(shè)計(jì)的AF1（AF1-F：5′-CTCCTCACAGGCGTTCGTAT

-3′和AF1-R：5′-AGATGCCTAGCCCCTTCAAC-3′）對(duì)分離病原菌進(jìn)行分子鑒定。擴(kuò)增體系：10×PCR Buffer（Mg2+ Plus）5.0 μL，2.5 mmol/L dNTPs 4.0 μL，引物（10 μmol/L）各1.0 μL，Taq 聚合酶（5 U/μL）0.5 μL，DNA模板2.0 μL，ddH2O 36.5 μL。擴(kuò)增條件：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)并拍照。以Fusarium mangiferae菌株MMD-23為陽性菌株（該菌株分離自四川省攀枝花市仁和區(qū)的芒果畸形花，與以色列Stanley Freeman教授商酌鑒定，引物1-3F/R對(duì)該菌的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為589 bp）。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌的分離與DNA提取

從具有典型癥狀的芒果腋芽分離獲得9株鐮刀菌，其中東方市5株（MMD-28～32）、三亞市4株（MMD-46～49），單孢純化后保存于PDA斜面，10 ℃低溫貯存、備用。

電泳檢測(cè)顯示，所提取的基因組總DNA片段較大，條帶清晰，無雜帶，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 致病性測(cè)定

按照柯赫氏法則，將分離得到的菌株回接到芒果苗腋芽下，注射濃度1×106個(gè)/mL的分生孢子懸浮液0.1 mL后，出現(xiàn)典型芒果畸形病癥狀（圖2-A），即腋芽膨大并產(chǎn)生大量嫩芽，圍繞主枝條長(zhǎng)一圈嫩芽，嫩芽數(shù)明顯多于空白對(duì)照，主枝條失去頂端優(yōu)勢(shì)，節(jié)間明顯變短。空白對(duì)照無任何畸形癥狀（圖2-B）。從接種發(fā)病部位再次分離、培養(yǎng)得到相同形態(tài)的病原菌，證明接種菌株為致病菌，符合柯赫氏法則。

2.3 病原菌形態(tài)學(xué)鑒定

在PDA培養(yǎng)基上，28 ℃光暗交替培養(yǎng)5 d菌落直徑達(dá)3.25 cm，氣生菌絲棉絮狀，白色至淺粉紅色，菌落邊緣略不整齊，基部無色素沉著（圖3-A）；產(chǎn)孢細(xì)胞著生于瓶狀小梗上，單瓶梗或復(fù)瓶梗（圖3-B），較短；瓶狀小梗細(xì)小，近圓柱形。PDA培養(yǎng)基上產(chǎn)生少數(shù)大型分生孢子（圖3-C），瘦長(zhǎng)，鐮刀狀，兩端略彎曲；頂端細(xì)胞尖端彎曲呈鳥喙?fàn)睿惆幻黠@；具3～5個(gè)隔膜，大小為（17～24）μm×（1～3）μm。PDA培養(yǎng)基上小型分生孢子（圖3-C）數(shù)量較多，形狀多樣，多為卵圓形、腎形、紡錘形等；多假頭狀著生；隔膜數(shù)0～2個(gè)，大小為（3～11）μm×（0.5～3）μm。培養(yǎng)過程未見厚垣孢子，未見有性態(tài)和菌核產(chǎn)生。從形態(tài)上初步鑒定為Fuasrium mangiferae。

2.4 病原菌的分子鑒定

對(duì)引物1-3F/R的DNA擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)顯示（圖4），分離得到的9株鐮刀菌中，6株（MMD-30、MMD-32、MMD-46～MMD49）擴(kuò)增得到了單一的589 bp條帶，與陽性對(duì)照菌株MMD-23條帶大小無差異，而陰性對(duì)照則無任何條帶，表明這6株鐮刀菌擴(kuò)增結(jié)果為陽性。引物AF1的擴(kuò)增反應(yīng)呈陽性的菌株與引物1-3F/R相同（圖4），擴(kuò)增產(chǎn)物大小為200 bp。該結(jié)果表明這兩對(duì)引物的擴(kuò)增結(jié)果相一致。

3 討論與結(jié)論

芒果畸形病的病原一直是國(guó)內(nèi)外關(guān)注的熱點(diǎn)[12]。目前，普遍認(rèn)為Fusarium sp.為該病病原菌[13]。1999年，F(xiàn)reeman等[14]將GUS報(bào)告基因轉(zhuǎn)入F. subglutinans，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化子能引起典型的畸形病癥狀，且發(fā)病組織中的侵染菌絲具有GUS活性，從而證明了F. subglutinans為芒果畸形病的病原菌。同樣，2010年，呂延超[15]將GFP（綠色熒光蛋白）轉(zhuǎn)入F. proliferatum，在芒果植株上注射接種分生孢子6個(gè)月后，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化子能引起典型的畸形病癥狀，且發(fā)病組織中能檢測(cè)到綠色熒光，從而證明F. proliferatum為芒果畸形病的致病菌。詹儒林研究團(tuán)隊(duì)通過致病性測(cè)定和分子鑒定，先后報(bào)道F. proliferatum[16]和F. mangiferae[9]為中國(guó)芒果畸形病的致病菌。Otero-Colina等通過RAPD-PCR、ap-PCR和致病性測(cè)定發(fā)現(xiàn)，墨西哥芒果畸形病的病原菌為F. pseudocircinatum、F. mangiferae、F. proliferatum、F. sterilihyphosum和F. mexicanum，其中F. mexicanum為新發(fā)現(xiàn)的致病菌[17]。

鐮刀菌的形態(tài)變異大，且不同種的鐮刀菌形態(tài)差異不明顯，如，F(xiàn). proliferatum 與F. verticillioides 在形態(tài)上很相似，二者的區(qū)別主要在于產(chǎn)孢細(xì)胞不同，且F. proliferatum的分生孢子鏈也較F. verticillioides短[18]。因此，即使對(duì)于非常專業(yè)的鐮刀菌分類學(xué)者來講，也需要借助傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)、生物學(xué)和分子生物學(xué)相結(jié)合的方法來準(zhǔn)確區(qū)分鐮刀菌屬下各個(gè)種[19]。目前，利用單拷貝基因設(shè)計(jì)種特異性引物，用以快速鑒定鐮刀菌屬中相關(guān)種的方法也已經(jīng)得到了廣泛應(yīng)用[5， 20]。Zhang和Ploetz[4]，Newman等[6]先后采用不同的分子標(biāo)記，先后獲得了F. mangiferae特異性鑒別引物，用于芒果畸形病病原菌的快速鑒定。但是，Zhang和Ploetz[4]所設(shè)計(jì)的特異性引物對(duì)鐮刀菌的擴(kuò)增過程中，存在一定的非特異性擴(kuò)增現(xiàn)象，將其設(shè)計(jì)的1-3F/R引物和Newman等[6]設(shè)計(jì)的AF1引物相結(jié)合，能夠更為準(zhǔn)確地進(jìn)行病原菌的鑒定，從而加快了該病菌的鑒別速度與準(zhǔn)確度。

本文運(yùn)用形態(tài)學(xué)鑒定、柯赫氏法則和分子鑒定技術(shù)首次鑒定了海南省東方市和三亞市的芒果畸形病的病原菌，供試菌株的形態(tài)與Crespo[5]等描述的F. mangiferae幾乎一致，且與李瑟組組內(nèi)F. mangiferae 特征最為接近。同時(shí)，采用參照Zhang和Ploetz[4]，Newman等[6]設(shè)計(jì)的F. mangiferae特異性引物，鑒定結(jié)果與預(yù)期一致。供試菌株的傳統(tǒng)方法和分子鑒定技術(shù)結(jié)果一致，因此，確定海南省東方市、三亞市的芒果畸形病的致病菌為F. mangiferae。海南省芒果畸形病病原菌的鑒定，為深入研究該病害的傳播途徑、流行規(guī)律、防治措施、病害檢疫奠定了重要基礎(chǔ)。

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