止咳枇杷顆粒微生物限度檢查方法驗證

郭秀秀

【摘 要】 目的：止咳枇杷顆粒的微生物限度檢查的方法驗證。方法：按《中國藥典》2010年版附錄微生物限度檢查法規定的方法進行驗證試驗。結果：大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、黑曲霉、白色念珠菌、金黃色葡萄球菌以常規法驗證回收率均大于70%。結論：止咳枇杷顆粒的細菌、霉菌和酵母菌的計數方法可采用常規法，控制菌可采用常規法檢驗。

【關鍵詞】 止咳枇杷顆粒；微生物限度檢驗法；方法驗證

【中圖分類號】R921.2 【文獻標志碼】 A 【文章編號】1007-8517（2015）13-0008-02

止咳枇杷顆粒是一種常用中成藥，具有清肺、止咳、化痰的作用，用于咳嗽多痰。處方由枇杷葉、白前、桔梗、桑白皮、百部、薄荷腦六味中藥組成，其中桔梗、百部、薄荷腦均具有一定的抑菌作用[1]。《中國藥典》2010版附錄Ⅻ-ⅠC微生物限度檢驗方法中規定，建立藥品的微生物限度檢驗方法必須進行方法驗證，確證供試液制備、測定方法及檢測系統適用于該藥品的檢驗，保證微生物限度檢驗方法的科學性和檢驗結果的準確性。本文參照2010年版《中國藥典》[2]、《中國藥品檢驗標準操作規范》[3]進行試驗，對止咳枇杷顆粒的微生物限度檢驗方法進行方法驗證，結果表明細菌、霉菌及酵母菌計數可采用常規法、控制菌檢查可采用常規法。

1 試驗環境與材料

1.1 試驗環境 根據2010年版《中國藥典》規定，試驗在環境潔凈度10000級、局部潔凈度100級的單向流空氣的無菌室進行，陽性菌操作在符合國家Ⅱ級生物安全標準的生物安全柜內進行。

1.2 實驗儀器 BHC-1300ⅡA2型生物安全柜（蘇州蘇凈儀器自控設備有限公司）；GHP-9162型電熱恒溫培養箱（上海金慧科電子有限公司）；MJX-160B-Z型微電腦霉菌培養箱（上海博訊實業有限公司醫療設備廠）；DYX-DHS型隔水式電熱恒溫培養箱（上海躍進醫療器械廠）；YXQ-LS-75SⅡ型立式壓力蒸汽滅菌器（上海市博訊實業有限公司醫療設備廠）；TZQ-Ⅱ型勻質器型號（天津市津德實驗儀器技術開發中心）。

1.3 供試品 止咳枇杷顆粒（批號：20140429、20140501、20140502，安徽省雪楓藥業有限公司）。

1.4 驗證菌種 大腸埃希菌（Escherichia coli）[CMCC（B） 44 102]、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）[CMCC（B） 63 501]、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC（B） 26 003]、白色念珠菌（Candida albicans）[CMCC（F） 98 001]均由中國醫學菌種保藏中心提供，黑曲霉（Aspergillus niger）[CMCC（F） 98 003]由中國藥品生物制品檢定所提供，試驗用菌株的傳代次數為3代。

1.5 培養基 營養瓊脂培養基（批號：121130）、玫瑰紅鈉瓊培養基（批號：110811）、營養肉湯培養基（批號：110406）、改良馬丁培養基（批號：130227）、曙紅亞甲藍瓊脂培養氧基（EMB，批號：1110102）、膽鹽乳糖培養基（批號：1111162）、4-甲基傘形酮葡糖苷酸（MUG，批號：1110102）均由北京三藥科技開發公司提供。

根據2010年版《中國藥典》附錄Ⅻ-ⅠC的規定，計數培養基符合計數培養基適用性檢查的要求；控制菌檢查用培養基符合促生長、指示和抑制能力的要求。

1.6 稀釋劑 0.9%無菌氯化鈉溶液（蚌埠豐原涂山試劑有限公司）；pH7.0的無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液（杭州微生物試劑有限公司）。

2 方法與結果

2.1 [JP3]菌懸液的制備 枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌在營養肉湯培養基中33℃培養24h，各取1ml培養物用0.9%無菌氯化鈉溶液10倍遞增稀釋至10-5、10-7、10-7，備用；白色念珠菌在改良馬丁液體培養基中經25℃培養24h，取培養物1ml用0.9%無菌氯化鈉溶液10倍遞增稀釋至10-5，備用；黑曲霉在改良馬丁斜面培養基中經25℃培養1周，用5ml含0.05%聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液洗下黑曲霉孢子，吸取經無菌棉花過濾的孢子菌懸液1ml，用0.9%無菌氯化鈉溶液10倍遞增稀釋至10-6，備用。[JP]

2.2 菌懸液中含菌量檢驗 取“2.1”中枯草芽孢桿菌10-5級稀釋液1ml放入已滅菌的平皿中，用45℃無菌營養瓊脂培養基20ml注皿且平行測定兩皿，33℃培養48h計數；取10-7級金黃色葡萄球菌、10-7級大腸埃希菌分別注皿培養，方法及培養條件同枯草芽孢桿菌。取“2.1”中白色念珠菌10-5級稀釋液1ml放入已滅菌的平皿中，用45℃玫瑰紅鈉瓊脂培養基20ml注皿，平行測定兩皿，25℃培養5d逐日觀察計數；取10-6級黑曲霉孢子菌懸液1ml注皿培養，方法及培養條件同白色念珠菌。

根據2010年版《中國藥典》規定，細菌、霉菌和酵母菌方法驗證所用菌懸液含菌量應為50～100 cfu/ml；控制菌方法驗證所用菌懸液含菌量為10～100 cfu/ml。結果見表1，符合要求。

2.3 供試液制備 取本品最小包裝兩袋（10g/袋），按微生物限度檢查法規定稱取10g，加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100ml，勻漿儀2000轉/min，3min混勻，即為1∶10的供試品溶液。

2.4 細菌、霉菌和酵母菌計數方法驗證

2.4.1 常規法 按照2010年版《中國藥典》規定需進行3次獨立的平行試驗，且每次每種菌種需平行2皿。

2.4.2 試驗組 取1∶10供試液1ml，枯草芽孢桿菌10-5級菌懸液1ml，注入無菌平皿，立即傾注45℃無菌營養瓊脂培養基20ml，待凝固后置33℃陽性細菌培養箱中倒置培養24～72h，逐日觀察結果并記錄。金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌同枯草芽孢桿菌。取1∶10供試液1ml，白色念珠菌10-5級菌懸液1ml，注入無菌平皿，立即傾注45℃無菌玫瑰紅鈉培養基20ml，待凝固后置25℃陽性霉菌培養箱中倒置培養5d，逐日觀察結果并記錄。黑曲霉同白色念珠菌。

2.4.3 菌液組 取枯草芽孢桿菌10-5級、金黃色葡萄球菌10-7級、大腸埃希菌10-7級菌懸液各1ml，分別注入平皿，立即傾注營養瓊脂培養基，待凝固后置33℃細菌陽性培養箱中培養24～72h，逐日觀察結果并記錄。取白色念珠菌10-5級和黑曲霉10-6級菌懸液各1ml，分別注入平皿，立即傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養基，待凝固后置25℃霉菌陽性培養箱中培養5d，逐日觀察結果并記錄。

2.4.4 供試品對照組 取1∶10供試液1ml，注入平皿，立即傾注45℃無菌營養瓊脂培養基或45℃無菌玫瑰紅鈉瓊脂培養基，待凝固后營養瓊脂培養基置陰性細菌培養箱中33℃培養24～72h，玫瑰紅鈉瓊脂培養基置陰性霉菌培養箱中25℃培養5d，逐日觀察結果并記錄。

2.4.5 稀釋劑對照組 取0.9%無菌氯化鈉溶液1ml，枯草芽孢桿菌10-5級1ml，注入平皿，立即傾注營養瓊脂培養基，待凝固后置33℃細菌陽性培養箱中培養24～72h，逐日觀察結果并記錄；金黃色葡萄球菌10-7級、大腸埃希菌10-7級方法同枯草芽孢桿菌。取0.9%無菌氯化鈉溶液1ml，白色念珠菌10-5級1ml，分別注入平皿，立即傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養基，待凝固后置25℃陽性霉菌培養箱中培養5d，逐日觀察結果并記錄。黑曲霉10-6級菌懸液方同白色念珠菌。

2.4.6 實驗結果 從表2可知，3次平行試驗枯草芽孢桿菌、大腸埃細菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌和黑曲霉的試驗組和稀釋劑對照組的回收率均大于70%，根據《中國藥典》2010版規定，可以采用常規法測定供試品中細菌、霉菌和酵母菌數。

2.5 控制菌（大腸埃希菌）檢查方法驗證

2.5.1 常規法 按照2010年版《中國藥典》規定需進行3次獨立的平行試驗，且每次每種菌種需平行2皿

2.5.2 試驗組 取已滅菌的裝有100ml膽鹽乳糖培養基的三角瓶一瓶，用無菌移液槍加入1∶10供試液10ml，10-7級大腸埃希菌菌懸液10ml，置35℃陽性培養箱中培養24h，按大腸埃希菌的檢查法檢查。

2.5.3 陰性對照組 取已滅菌的裝有100ml膽鹽乳糖培養基的三角瓶一瓶，用無菌移液槍加入0.9%無菌氯化鈉溶液10ml，置35℃陰性培養箱中培養24h，按大腸埃細菌的檢查法檢查。

2.5.4 陽性對照組 取已滅菌的裝有100ml膽鹽乳糖培養基的三角瓶一瓶，用無菌移液槍加入10-7級大腸埃希菌菌懸液10ml，置35℃陽性培養箱中培養24h，按大腸埃希菌的檢查法檢查。

2.5.5 供試品組 取已滅菌的裝有100ml膽鹽乳糖培養基的三角瓶一瓶，用無菌移液槍加入1∶10供試液10ml，置35℃陽性培養箱中培養24h，按大腸埃希菌的檢查法檢查。

2.5.6 陰性菌對照組 陰性對照菌采用10-7級金黃色葡萄球菌，方法同試驗組。

2.5.7 實驗結果 由表3可知，大腸埃希菌陽性組、試驗組生長良好，說明止咳枇杷顆粒對大腸埃希菌無抑菌作用或抑菌作用較弱，可以采用常規法檢查。

3 結果與討論

3.1 上述驗證結果 止咳枇杷顆粒采用常規法測定細菌、霉菌及酵母菌的試驗組和稀釋劑對照組回收率均大于70%，說明可以采用常規法對細菌、霉菌、酵母菌及控制菌中大腸埃希菌進行檢驗且采用0.9%無菌氯化鈉溶液作為稀釋劑對試驗不產生影響。

3.2 方法驗證中陽性菌會造成環境污染 必須嚴格按照2010年版《中國藥典》附錄中方法驗證的規定，在無菌室的生物安全柜內操作，做好防護措施。同時供試品組及陰性對照組應在符合規定的潔凈室內操作。

3.3 方法驗證需進行三次獨立的平行實驗 為使結果獲得良好的重現性，所加的培養基體積應盡量一致，培養基與所加試液應充分混合均勻。

3.4 菌落計數 菌落計數是方法驗證實驗過程中極為重要的一步，因此計數時應仔觀察，必要時可借助放大鏡等工具，排除藥渣和小氣泡的干擾，減少操作誤差。

參考文獻

[1] 南京中醫藥大學.中藥大辭典[M].上海：上海科學技術出版社，2006：833-5553.

[2] 國家藥典委員會編.中華人民共和國藥典（一部）[S].北京：中國醫藥科技出版社，2010：107-116.

[3] 中國藥品生物制品檢定所，中國藥品檢驗總所.中國藥品檢驗標準操作規范[S].北京：中國醫藥科技出版社.2010：351-369.

（收稿日期：2015.04.02）