番鴨呼腸孤病毒檢測技術研究進展

莊金秋 梅建國 王金良 姚春陽 王玉茂

摘 ?要：番鴨呼腸孤病毒病是危害養鴨業的一種重要傳染病。本文概述了番鴨呼腸孤病毒（MDRV）實驗室檢測方法的研究進展。在細胞生物學方面，主要依靠病毒分離培養、ELISA法、血清中和試驗等病毒特異性抗原及其抗體的檢測等。在分子生物學方面，主要依靠國內外相繼建立起的RT-PCR技術、實時熒光定量RT-PCR技術、LAMP技術和核酸雜交技術等。介紹和比較了各種方法的優缺點和實用性，為臨床科技工作者建立快速、簡便、準確、實用的檢測方法提供參考。

關鍵詞：番鴨;呼腸孤病毒;檢測;研究進展

中圖分類號：S858.324.4+3 ? ? 文獻標識碼：A ? ? 文章編號：1673-1085（2015）06-0050-06

番鴨呼腸孤病毒（Muscovy duck reovirus，MDRV）病俗稱“肝白點病”、“花肝病”，是由番鴨呼腸孤病毒引起的番鴨的一種以軟腳、肝脾灰白色壞死點為特征的急性病毒性傳染病。禽呼腸孤病毒（Avian reovirus，ARV）和MDRV均是呼腸孤病毒科正呼腸病毒屬的成員。正呼腸孤病毒屬包括哺乳動物呼腸孤病毒和禽呼腸孤病毒。根據最新國際病毒學分類委員會第七次分類報告（2000）：哺乳類呼腸孤病毒（MRV）為I亞群，禽類呼腸孤病毒為II亞群，納爾遜海灣病毒（NBV）和沸沸呼腸孤病毒（BRV）為III亞群。雞感染ARV的臨床癥狀表現為病毒性關節炎。MDRV主要危害10～40日齡的雛番鴨以及雛半番鴨，發病率和死亡率較高，日齡愈小病死率愈高，發病鴨耐過后生長發育受阻或成為僵鴨。該病主要影響番鴨的育雛及存活率，流行勢態日趨嚴重，感染宿主范圍不斷擴大且有呈多致病型發生的態勢，是危害番鴨養殖業的重要傳染病之一，給番鴨養殖業造成了嚴重的經濟損失。本文就近年來MDRV的實驗室檢測方法研究進展作一簡要綜述，以期為病毒的進一步深入研究和疾病的有效防控提供參考。

1 ?病毒分離與鑒定

MDRV可以在禽胚卵黃囊、尿囊腔和絨毛尿囊膜中復制增殖。初次分離MDRV通常選用卵黃囊途徑接種禽胚，一般可在接種后3～5d致死胚，表現為胚胎蜷縮，胚體全身皮下出血，呈紫紅色;肝、脾有時可見腫大和壞死;死亡胚尿囊液清亮等。MDRV也可以在多種禽胚原代細胞（肝、肺、腎和成纖維細胞等）培養物中增殖，其中最常用的是番鴨胚成纖維細胞（MDEF）和雞胚成纖維細胞（CEF）。不同分離株的MDRV感染MDEF或CEF產生的病變有所差異：Malkinson等（1981）[1]證明MDRV能在MDEF上增殖，其細胞病變（CPE）為細胞融合和崩解;陳志勝等[2]（2005）、陳仕龍等[3]（2013）證明MDRV感染MDEF后細胞融合形成體積巨大含多個細胞核的合胞體，細胞質產生嗜酸性或嗜堿性包涵體;吳寶成等[4]（2001）證明其分離毒在MDEF和CEF上繁殖的CPE為細胞融合和崩解;胡奇林等[5]（2004）證明MDRV能在MDEF和CEF上繁殖，CPE為細胞圓縮和崩解，無細胞融合現象。MDRV病毒具有較廣的細胞親嗜性，能在雞胚成纖維細胞的傳代細胞系（DF1）、非洲綠猴腎細胞（vero）、恒河猴腎細胞（Marc145）、犬腎細胞（MDCK）、乳倉鼠腎細胞（BHK-21）、豬睪丸細胞（ST）、人胚腎細胞（AD293）等多種傳代系細胞中增殖并產生CPE。待病毒增殖后可通過電鏡觀察其形態結構以及分析理化特性進一步對病毒進行鑒定。病毒分離與鑒定雖然十分準確可靠，但是存在整個操作過程比較復雜，耗時費力，而且常常出現病毒分離不成功或CPE長時間不出現的情況。

2 ?血清學方法

2.1 ?瓊脂擴散試驗（AGP） ?AGP操作簡單、快捷、便于推廣，可用于檢測MDRV的群特異性抗體，易于與其他病毒區分。該方法還可以用于病毒感染史的檢測、分離株的鑒定以及血清學的監測等。王錫壟等[6]（1985）率先建立了AGP試驗用于檢測ARV抗原。隨后，朱萬光等[7]（1996）利用vero細胞、原代CEF細胞制備ARV的AGP抗原，建立了雞病毒性關節AGP試驗，用于雞感染ARV的普查。陳士友等[8]（1991）、單松華等（1993）[9]先后建立了檢測ARV抗體的AGP方法。AGP可以用于MDRV抗體的流行病學調查，但是該方法敏感性不高，不適用于檢測低滴度的抗體。

2.2 ?血清中和試驗（SN） ?血清中和試驗主要用于對MDRV進行血清型的鑒定，是經典的血清學檢測方法。Kawamura[10]（1965）通過對其分離到的77株ARV進行SN試驗并將這些毒株分為5個血清型。Wood等[11]（1980）認為ARV至少存在13個血清型。Robertson等[12]（1986）應用交叉中和試驗發現各型間存在大量的交叉反應，因此有些只能作為亞型而不能作為獨立的血清型。SN試驗結果準確，但程序復雜，耗時費力，不能用于快速診斷及大批血清樣品的檢測。

2.3 ?免疫熒光試驗（IF） ?免疫熒光試驗分為直接免疫熒光試驗和間接免疫熒光試驗（IFA），前者適用于感染組織中抗原的檢測，后者可以用于抗原和抗體的檢測。該方法與AGP相比更敏感，同時可用于病毒和ARV群特異性抗體的定量分析。肖成蕊等[13]（1990）制備了ARV熒光抗體，建立了檢測ARV抗原的直接免疫熒光試驗方法，對人工感染雞和自然發病雞的主要臟器進行檢測，結果發現，肝臟和脾臟的檢出率可達100%，而心臟和腎臟等的檢出率為40%左右，說明該方法可以用于臨床樣品的檢測，并且肝臟和脾臟是檢測ARV的首選器官。王瑩[14]（2010）、謝志勤等[15]（2012）也先后建立了檢測ARV抗原的直接免疫熒光試驗方法，表明該方法具有很好的特異性、重復性和穩定性。高春亮等[16]（2012）制備了具有免疫熒光特性的抗MDRV單克隆抗體，建立了檢測MDRV抗原的間接免疫熒光（Mab-IFA）方法，表明該方法操作簡便、特異性強、檢測只需要2h，可用于MDRV感染的快速檢測，為臨床MDRV的快速診斷奠定了基礎。

2.4 ?酶聯免疫吸附試驗（ELISA） ?ELISA是目前應用最為廣泛的一種免疫學監測方法。國內外已建立了檢測MDRV抗原或抗體的多種ELISA方法，從而使大量樣品的篩檢更加快速化和自動化。Slaght等[17]（1979）最先建立了檢測ARV抗體的ELISA方法。朱萬光等[18]（1998）將ARV感染CEF和vero細胞后制備了ARV抗原，并建立了檢測ARV抗體的間接ELISA方法。Liu等[19]（2000）用σC和σA的單克隆抗體E9和H3，建立了Dot-ELISA方法，可檢測細胞培養物和鍵組織樣品中的ARV。Hung等[20]（2000）用純化的σB蛋白作為包被抗原，建立了檢測ARV抗體的σB-ELISA檢測方法。該方法可以克服全病毒包板產生的非特異性，與SN相比，檢測靈敏度更高。Liu等[21]（2002）用原核表達的σC和σB蛋白作包被抗原，建立了檢測DRV抗體的σC-σB-ELISA檢測方法，與SN的符合率達到100%，可以減少傳統ELISA的非特異性結合。耿宏偉等[22]（2006）以原核表達的MDRV重組σC蛋白作為包被抗原，建立了檢測鴨血清中MDRV抗體的間接ELISA方法。用該方法對50份鴨血清樣品進行了檢測，與AGP法相比，ELISA具有良好的特異性和敏感性，為MDRV抗體檢測試劑盒的研制和應用奠定了基礎。鄒光盛[23]（2007）、張云等[24]（2008）、孫美玉[25]（2012）也先后建立了σC蛋白為抗原的檢測DRV抗體的間接ELISA方法，具有較高的臨床使用價值，可以用于DRV感染的流行病學調查以及群體DRV抗體水平的診斷和監控。Yang等[26]（2010）通過在酵母中表達的σC和σB蛋白作為包被抗原，建立了用于檢測ARV抗體的ELISA方法。共建立了兩種試劑盒，分別為1071的σC蛋白和S1133的σB蛋白等量混合作為抗原以及S1133 σC-σB融合蛋白作為抗原，結果表明建立的ELISA方法比常規ELISA具有更高的陽性率。Chen等[27]（2004）建立了非結構蛋白σNS的單克隆抗體（MAb）捕獲ELISA方法用以檢測ARV抗體。該方法比常規ELISA的非特異性結合更低，免疫過滅活苗的呈陽性，可用于ARV滅活苗的免疫狀況監測。謝芝勛等[28]（2007）以非結構蛋白P17建立了P17-ELISA檢測方法，可用于鑒別ARV滅活疫苗免疫和活病毒感染。Xie等[29]（2010）利用原核表達的非結構蛋白σNS和P17建立了檢測抗體的ELISA方法，該方法可用于區分疫苗免疫的雞群和野毒感染的雞群。秦宇[30]（2005）、謝芝勛等[31]（2007）先后以表達的ARV σ3融合蛋白純化后作為抗原，建立了檢測ARV抗體的間接ELISA方法。秦春香等[32]（2009）建立了能檢測ARV抗體的σ3-ELISA、σ2-ELISA以及σ3、σ2兩個蛋白同時包被的σ3-σ2-ELISA檢測方法。分別用上述3種方法對制備的33份ARV SPF雞陽性血清進行檢測，結果陽性檢出率分別為90.91%、69.70%和100%。表明σ3-σ2-ELISA方法在ARV抗體檢測方面具有較高的敏感性。謝志勤等[33]（2013）建立了檢測ARV抗原的雙抗體夾心ELISA方法。孫陳莉[34]（2013）分別建立了檢測MDRV抗原和抗體的方法，包括兩個方面：一是以大腸桿菌表達的MDRV σB蛋白作為包被抗原，建立檢測MDRV抗體的間接ELISA方法;二是研制針對MDRV的單克隆抗體，建立了檢測MDRV抗原的雙抗體夾心ELISA（DAS-ELISA）方法。焦玉蘭等[35]（2013）通過氯仿抽提卵黃抗體方法，經ELISA法檢測雞卵黃和血清中ARV抗體的相關性試驗，確定卵黃抗體和血清抗體的對應關系，并依此建立了ELISA試劑盒檢測卵黃抗體的檢測方法及判定標準。雖然采用ELISA作為診斷手段具有快速、敏感、特異的優點，但由于存在血清型之間交叉反應性強弱的問題，容易造成漏診或誤診。

2.5 ?乳膠凝集試驗（LAT） ?LAT簡便、快速、敏感，特異，既可以從攻毒或鴨的糞便中檢出MDRV抗原，又可以檢測血清中的抗體。王全溪[36]（2004）建立了檢測MDRV抗原的反向LAT方法，適合于獸醫基層臨床對MDRV的檢測。但是該方法需要特定的條件，而且與ARV雞源毒株發生凝集反應，特異性不是很好。吳異健等[37]（2005）用純化的抗MDRV抗體致敏乳膠成功地建立了檢測MDRV的反向LAT方法。結果表明，MDRV抗體致敏的乳膠無自凝性，特異性強，重復性好，質量可靠。檢測10份MDRV尿囊液與AGP方法進行比較，二者的陽性符合率為100%，這對臨床上診斷與防治MDRV感染具有重要的參考意義。韓典霖[38]（2007）利用原核表達、純化的MDRV-YB株的重組σC蛋白作為抗原致敏乳膠，建立了檢測MDRV抗體的LAT方法，該方法檢測抗體的敏感性高、特異性強、穩定性好。

2.6 ?免疫組化技術 ?免疫組化法是一種使用標記的抗體對細胞或組織中的特異性抗原進行定性和定位檢測的方法，其中酶標法應用最為廣泛應用，具有敏感性高、特異性強且可以檢測組織中極微量的病原體等優點。包漢勛等[39]（2009）利用純化的兔抗MDRV多克隆抗體，建立了檢測MDRV的間接酶免疫組化方法。應用該法對雛番鴨人工感染MDRV，研究MDRV在番鴨體內的分布規律，結果表明病毒對肝臟、脾臟、盲腸的組織嗜性最強，為該病毒的主要靶器官，這為闡明MDRV感染的發病機理提供了理論依據。王全溪等[40]（2009）通過對雛番鴨人工感染MDRV后，采用免疫組織化學技術檢測外周血淋巴細胞轉化率，證實MDRV可以誘導免疫抑制。

3 ?分子生物學方法

3.1 ?RT-PCR技術 ?RT-PCR技術快速、敏感、特異性強，已被廣泛應用于MDRV的檢測。Lee等[40]（1998）通過對ARV的S3基因設計引物，建立了RT-PCR方法，最低可以檢測到0.2pg的RNA。謝芝勛等[41]（2001）根據S1133株Sl基因序列設計兩對引物，建立了檢測ARV的半巢式RT-PCR，最低能檢測到1pg的病毒RNA。廖敏等[42]（2004）建立的一步法RT-PCR最低則能檢測到0.16ng的病毒RNA。胡奇林等[43]（2004）建立了檢測MDRV的RT-PCR方法，檢測靈敏度為1pg，但檢測的樣品須為細胞毒或尿囊液，不能檢組織病料，病毒培養需要時間長，因此不適合作為臨床快速診斷的手段。Liu等[44]（2004）建立了一種RT-PCR結合限制性片段長度多態性分析（RFLP）的方法，有助于鑒定禽群中是否存在變異株，或檢測特定株在禽群中的水平傳播情況。Bruhn等[45]（2005）根據ARV 52和54基因建立的RT-PCR方法，適用于檢測疫苗中污染的外源ARV。林鋒強等[46]（2007）建立了半套式RT-PCR方法檢測MDRV，敏感度達1pg，檢測人工感染MDRV的樣品和臨床疑似樣品與病毒分離相比較，二者的符合率為100%。王劭等[47]（2011）建立了RT-PCR方法檢測NDRV，敏度達2pg。李啟強[48]（2012）建立了檢測MDRV的套式RT-PCR方法，靈敏度可達0.1pg。周五朵等[49]（2014）根據MDRV YB株P10蛋白基因和YJL株P17蛋白基因分別設計了2對特異性引物，建立了可鑒別診斷2個毒株的雙重PCR方法，為臨床檢測ARV、MDRV提供借鑒，對生產具有很強的實用性。卿柯香等[50]（2014）根據S3基因設計引物，建立了能夠同時快速檢測MDRV和NDRV的雙重RT-PCR方法。

3.2 ?熒光定量RT-PCR技術 ?熒光定量PCR與傳統的PCR相比，能有效減少試驗中的污染，具有檢測快速、批量、靈敏度高、特異性強、可以定性和定量檢測等優點。Guan等[51]（2006）在RT-PCR的基礎上，建立了能定量研究ARV的Light Cycler熒光定量PCR方法，該方法的靈敏度是常規RT-PCR方法的1000倍以上，且不需要進行巢式PCR的二次加樣，能很好地避免加樣造成的污染。童桂香等[52]（2007）應用SYBR Green I染料法在ARV σC蛋白序列的保守區設計引物，建立了熒光定量RT-PCR方法，該方法檢測病毒RNA的量可達到5.2×102個拷貝，具有較高的靈敏度，但是熒光染料能與非特異的雙鏈DNA結合，使試驗產生假陽性信號。嚴進等[53]（2009）根據MDRV的σNS基因序列設計引物及TaqMan探針，建立了TaqMan探針實時熒光定量RT-PCR方法，可以檢測到1.0×102拷貝/μl的標準品，比普通PCR至少高100倍。該方法對MDRV人工感染番鴨肝臟組織檢出率達到100%。熊文婕等[54]（2010）建立了定量檢測ARV σC和σNS基因的SYBR GreenⅠ實時熒光定量RT-PCR方法。孫美玉[55]（2012）建立了針對ARV σC基因TaqMan熒光定量RT-PCR方法。Guo等[56]（2011）建立的TaqMan熒光定量RT-PCR方法可檢測到5個拷貝/μl的標準品，靈敏度約為常規RT-PCR的150倍，相比Light Cycler熒光定量PCR方法，既能滿足檢測的要求，也能進行病毒的定量分析。楊旭[57]（2011）建立了檢測MDRV的SYBR GreenⅠ熒光定量RT-PCR方法，對收集的80份人工感染樣品和10份臨床樣品分別用常規RT-PCR和建立的熒光定量RT-PCR方法進行檢測。結果顯示，人工感染樣品中，熒光定量RT-PCR檢出率（52.5%）高于常規RT-PCR（45%）;臨床樣品中，熒光定量RT-PCR檢出率（60%）也高于常規RT-PCR（30%）。表明其所建立的熒光定量RT-PCR比RT-PCR敏感性高，可以為MDRV感染提供快速而準確的診斷方法。袁遠華等[58]（2013）建立了針對新型鴨呼腸孤病毒（NDRV）S3基因的SYBR GreenⅠ熒光定量RT-PCR方法，可以實時定量分析病毒核酸在動物體內的含量，從而明確NDRV感染程度，并能夠為NDRV的早期檢測提供重要參考。

3.3 ?環介導等溫擴增技術 ?環介導等溫擴增技術（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）在靈敏度、特異性、擴增時間、檢測范圍上都優于常規PCR技術，而且不需要精密儀器，一般用恒溫水浴鍋就可以在短時間內進行目的片段的擴增，檢測成本低于熒光定量PCR，該方法簡便快捷，省時省力，是一種適用于基層實驗室快速、準確檢測MDRV的方法。董嘉文等[59]（2011）針對ARV S1基因設計1套LAMP引物，建立了檢測ARV的LAMP方法。馬利等[60]（2013）使用2種熒光顯色劑（SYBR Green Ⅰ和鈣黃綠素）建立了檢測ARV的LAMP方法。在對80份臨床樣本的檢測中，使用LAMP和PCR檢測出陽性樣本的數量分別為68份和55份。認為基于熒光顯色的LAMP方法可以應用于ARV的快速檢測，具有在科研機構、基層實驗室特別是檢測現場推廣和應用的潛力。

3.4 ?核酸探針技術 ?核酸探針技術是在己獲得的病毒特異片段上標記放射性同位素或生物素作為探針而建立的一種分子雜交方法，是定性或定量檢測特異RNA或DNA序列的有力工具，已被廣泛應用于ARV的檢測上。Liu等[61]（1997）通過地高辛標記建立的cDNA探針技術，可直接檢測組織切片及細胞中的微量RNA，最低檢測量為0.78ng。該方法不僅能定位感染組織中的ARV，還能在臨床癥狀出現前檢測到ARV，具有較高的靈敏性。Yin等[62]（1998）建立的以放射性32P標記的核酸探針，最低檢測劑量達0.2ng，特異性較強，但該放射性探針具有使用不安全的缺點，很難推廣。謝芝勛等[63]（2001）也建立了地高辛標記的cDNA探針技術，但其靈敏度較Liu建立的方法高，最低檢出量為0.45ng。造成這種差異的原因可能與探針的設計存在關系。王蕾等[64]（2007）用地高辛標記ARV S1基因中編碼σC蛋白的基因片段作為核酸探針，在斑點分子雜交中可檢測到1.6pg的RNA。表明其建立的核酸探針檢測方法靈敏度高、特異性強和操作簡便，適于批量樣品的檢測。核酸探針技術敏感，但操作較繁瑣，適用于實驗室檢測及其出入境動物的檢疫。

4 ?小結

MDRV在我國番鴨群中普遍存在，常常與其他細菌或病毒的繼發感染或并發感染，引起常規疫苗的免疫效果不佳。MDRV和AIV對法氏囊均有一定程度的免疫抑制，共感染后引發更為嚴重的免疫抑制，對于防控禽流感將是更嚴峻的問題。因此，做好番鴨呼腸孤病的防控將會對其他疾病起到積極的作用。另外，MDRV和NDRV在流行病學、臨床癥狀和病理變化等方面存在較大差異。MDRV易感動物主要是雛番鴨，而NDRV的宿主范圍較廣，各品種鴨都易感。明確這兩種不同疾病型水禽呼腸孤病毒病的病原學特征，將為研究兩病毒引起的致病性差異的機制奠定基礎，也為水禽呼腸孤病毒病的有效防控和實用疫苗的設計提供科學依據。黃瑜等[65]（2009）將我國感染MDRV相關的疾病歸結為4種，即鴨多臟器壞死癥、多臟器出血癥、肝壞死癥和脾壞死癥。導致這一結果的因素，很可能與病毒的毒力、基因型、血清型、抗原性、組織親嗜性或者致病性等有關。建立快速、準確的檢測方法，進行分子流行病學調查，開發有針對性的新型疫苗等防控產品，是控制該病頻發和暴發的基礎和關鍵，具有十分重要的意義。上述MDRV的血清學和分子生物學檢測方法各有優點和缺點，需要根據不同的場合、條件等選擇使用其中的一種或者多種方法。雖然上述檢測方法為MDRV的檢測提供了有效的技術手段，但是隨著人們對MDRV深入研究，相信現有的檢測方法將不斷的得到改進或者新的檢測方法將很快研制出來，以使其檢測技術更簡便化、快速化和準確化，這將對番鴨呼腸孤病毒病的有效防控產品及技術的研制奠定基礎。

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（[26-65]參考文獻略）