柑橘潰瘍病菌LAMP實時濁度檢測方法的建立及應(yīng)用

封立平等

摘 要 以柑橘潰瘍病菌特異性高的假定蛋白基因（登錄號：AE008923.1）為靶標，設(shè)計并篩選4條引物來特異性識別靶標序列中的6個獨立區(qū)域，建立柑橘潰瘍病菌LAMP實時濁度檢測方法。該方法利用實時濁度儀檢測反應(yīng)過程中產(chǎn)生的焦磷酸鎂白色沉淀，實現(xiàn)對LAMP整個反應(yīng)過程的實時監(jiān)控。從鎂離子濃度、甜菜堿濃度、dNTPs濃度、引物濃度和反應(yīng)溫度5個變量參數(shù)對 LAMP檢測體系進行優(yōu)化，并對方法的特異性、靈敏度、穩(wěn)定性及實際樣品檢測效果進行評價。結(jié)果顯示，該體系經(jīng)優(yōu)化后穩(wěn)定性良好，可在66 ℃ 恒溫條件下，60 min內(nèi)完成檢測；DNA檢測下限可達0.02 ng/μL，靈敏度與熒光定量PCR方法相同，比常規(guī)PCR方法高1個數(shù)量級；能快速、準確地對田間疑似樣品進行檢測，與熒光定量PCR方法的檢出情況一致，沒有漏檢。結(jié)果說明柑橘潰瘍病菌實時濁度LAMP檢測方法操作簡便、所需時間短，特異性與靈敏度高，為柑橘潰瘍病菌的快速篩查提供較好的途徑。

關(guān)鍵詞 LAMP實時濁度檢測方法；柑橘潰瘍病菌；檢測

中圖分類號 S 436.661.1 文獻標識碼 A

Abstract The conserved hypothesis protein sequence published in GenBank（accession no.AE008923.1）of Xanthomonas axonopodis pv. citri was used to design a set of four special primers that recognized six distinct sequences of the conserved region of X. axonopodis pv. citri genome， and a real-time turbidity method for rapid detection of X. axonopodis pv. citri by loop-mediated isothermal amplification（LAMP）was established. Real-time monitoring of magnesium pyrophosphate produced from the LAMP reaction was achieved by the turbidimeter.The LAMP detection system was optimized by five variable parameters： magnesium ion concentration， dNTPs concentration， betaine concentration， primer concentration and reaction temperature， and the specificity， sensitivity， stability， and effect on real samples of this method were evaluated. Results showed that after optimizing the detection system the stability was good and detection was completed at 66 ℃ in 60 minutes.The lowest DNA detection limit was 0.02 ng/μL，with the same sensitivity as the real time Q-PCR method， but 10 times higher than the PCR method. This method could do field detection of suspected samples quickly and accurately， consistent with the fluorescence PCR detection methods without any missing cases. The LAMP real-time turbidity detection method is easy and quick to operate， with high specificity and sensitivity， and provides a good method for the rapid screening of X. axonopodis pv. citri. LAMP Real time turbidity method established in this study is a new method of LAMP detection of X. axonopodis pv. citri， has not been reported at home and abroad.

Key words LAMP real-time turbidity method； Xanthomonas axonopodis pv. citri； Detection

由地毯草黃單胞柑橘致病變種[Xanthomonas axonopodis pv. citri（Hasse） Vauterin et al.，簡稱柑橘潰瘍病菌]引起的柑橘潰瘍病（citrus bacterial canker disease，CBCD）是中國重要的檢疫性有害生物，對柑橘生產(chǎn)危害極大，世界大部分國家對該病菌都有嚴格的檢疫要求。該病目前廣泛分布于亞洲、太平洋、印度洋島國、非洲、南美洲和北美洲的30多個國家和地區(qū)。在中國已有14個省市（包括臺灣）的柑橘產(chǎn)區(qū)有該病發(fā)生，尤以甜橙、柚和柑發(fā)生較嚴重[1-2]。

柑橘潰瘍病菌，即舊的細菌分類系統(tǒng)中Xanthomonas campestris pv. citri中的A菌系，目前在Vauterin的新分類系統(tǒng)中被劃分在地毯草黃單胞桿菌（Xanthomonas axonopodis）[3]。柑橘潰瘍病菌侵染未老化的葉片、新梢和幼果形成病斑，嚴重時引起落葉、落果和枝梢枯死。同時，果實受害后還會影響外觀、降低商品價值。柑橘潰瘍病菌還有潛伏侵染現(xiàn)象，給此病的檢疫、采穗和防治工作帶來困難。柑橘潰瘍病發(fā)生后，沒有有效的防治辦法，只能通過砍樹燒毀等措施杜絕病害蔓延，對果農(nóng)的利益造成極大的沖擊[4]。因此迫切需要建立一種簡單可靠的快速篩選方法，以便更好地對該菌進行檢疫和監(jiān)測，為柑橘潰瘍病的防控提供可靠的資料和數(shù)據(jù)。

長期以來科研人員已對柑橘潰瘍病進行了多種檢測方法的研究。ELISA檢測技術(shù)方法[5]、普通PCR檢測方法[6]、熒光定量PCR檢疫檢驗方法[7-8]、滾環(huán)擴增檢測方法[9]、分子指紋圖譜鑒別方法[10-11]等已被應(yīng)用于柑橘潰瘍病菌的檢測。一些新的檢測手段如脂肪酸色譜圖檢測法、激光檢測法、噬菌體檢驗方法[12]等也相繼展開，但這些檢測技術(shù)普遍存在檢測周期長、假陽性和誤判率高、靈敏度差、儀器設(shè)備昂貴、檢測過程復(fù)雜等缺點，限制了其在基層的推廣。環(huán)介導(dǎo)恒溫擴增（loop-mediated isothermal amplification， LAMP）是日本榮研化學(xué)株式會社Notomi等[13]在2000年發(fā)明并建立的一種新型核酸擴增方法，該技術(shù)通過設(shè)計兩對特異性引物識別靶基因的6個特定區(qū)域，檢測結(jié)果只通過擴增產(chǎn)物的有無來判別，在恒溫條件下，15～90 min內(nèi)可擴增 109～ 1010倍，免去了反復(fù)升溫降溫的過程，使得擴增過程更加簡便。LAMP技術(shù)目前已在病原微生物的檢測中得到廣泛應(yīng)用[14-15]。

起初，LAMP技術(shù)主要是利用水浴鍋和金屬浴等加熱裝置反應(yīng)，觀察LAMP反應(yīng)中的副產(chǎn)物焦磷酸鎂沉淀，或者通過SYBR Green I染料顯色進行結(jié)果判定，但由于LAMP高溫反應(yīng)產(chǎn)生的氣溶膠容易導(dǎo)致污染，后來發(fā)展了不開蓋檢測技術(shù)來避免污染。隨著LAMP RealTime Turbidimeter LA-320c等濁度儀的開發(fā)利用，人們開始采用濁度儀對LAMP反應(yīng)產(chǎn)生的副產(chǎn)物焦磷酸鎂沉淀的濁度進行實時檢測和定量分析。因為DNA濃度、焦磷酸鎂、濁度三者呈線性相關(guān)，因此可依據(jù)DNA和濁度之間的相關(guān)性構(gòu)建標準曲線從而實現(xiàn)目標基因的檢測[16-17]。該技術(shù)的優(yōu)點是在恒溫條件下1 h即可完成擴增，耗時短，并可通過設(shè)置分析標準排除假陽性和非特異性反應(yīng)等干擾引物，使得檢測結(jié)果更加有效、準確，是新一代的LAMP檢測方法[18-19]。本研究建立了柑橘潰瘍病菌Xanthomonas axonopodis pv. citri的LAMP實時濁度檢測方法，對優(yōu)化后的LAMP反應(yīng)體系進行了特異性、靈敏性和穩(wěn)定性檢測，同時與PCR檢測技術(shù)進行了靈敏度的比較。該方法為口岸和基層實驗室檢疫和監(jiān)測柑橘潰瘍病菌，防止病菌傳入侵風(fēng)險，保證無病苗木繁育和生產(chǎn)提供了新的技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料 感染柑橘潰瘍病菌（Xanthomonas axonopodis pv. citri）的柑橘葉片由中國農(nóng)科院柑橘研究所贈送，柑橘黃龍病菌亞洲種（Candidatus Liberobacter asiaticum）、短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）、短波單胞桿菌（Brevundimonas segers）、鞘胺醇單胞嗜冷桿菌（Psychrobacter sp.）、水稻細條病菌（Xanthomons. oryzae pv. oryzicola）、蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、蠟質(zhì)芽孢桿菌（Bacillus cereus）均由重慶出入境檢驗檢疫局植物檢疫實驗室提供。野油菜黃單胞桿菌（Xanthomons campestris pv. campestris）、番茄細菌性潰瘍病菌（Clavibater michiganensis）、大白菜軟腐病菌（Erwinia carotovora subsp. carotovora）均由山東出入境檢驗檢疫局植物檢疫實驗室提供。

1.1.2 試劑與儀器 WizardR Genomic DNA Purification Kit、Bacterial DNA Kit和小量質(zhì)粒DNA提取試劑盒購自O(shè)MEGA公司；Taq DNA Polymerase、dNTP Mixture、MgCl2、PCR buffer購自Promega公司；LAMP DNA擴增試劑盒購自日本榮研化學(xué)株式會社；DNA Marker（DL2000）購自寶生物（大連）有限公司；LB液體培養(yǎng)基購自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司。

生物安全柜（北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司），臺式高速冷凍離心機（德國SIGMA公司）、水浴鍋（南通凱達實驗儀器有限公司）、空氣浴搖床、球磨儀（德國Retsch公司）、電泳儀（美國BioRad公司）、凝膠成像系統(tǒng)[西盟生命技術(shù)（國際）有限公司]、LAMP RealTime Turbidimeter LA-320c（日本榮研化學(xué)株式會社）、熒光定量PCR儀（美國ABI公司）、PCR儀（美國ABI公司）。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 取小片新鮮病葉組織，經(jīng)表面消毒后剪碎，放入充分預(yù)冷的研缽中， 加入液氮迅速研磨至粉末狀，用promega wizard基因組DNA提取試劑盒提取樣品總DNA，保存于-20 ℃冰箱備用。

1.2.2 引物的設(shè)計 根據(jù)巴西Silva等報道的柑橘潰瘍病菌染色體全基因組序列（登錄號：AE008923.1）與野油菜黃單胞菌（X. campestris pv. campestris）全基因組序列（登錄號：AE008922.1）的同源性比對，選擇柑橘潰瘍病菌特異性高的假定蛋白（hypothesis protein）基因，利用LAMP引物在線設(shè)計軟件Primer Explorer V4.0（http：//primerexplorer.jp/e/），根據(jù)Tm值、各引物的末端安定性、GC對含量、引物間距離、二次結(jié)構(gòu)等條件設(shè)計5組LAMP引物，引物序列見表1。引物由上海生工生物工程有限公司合成。按照榮研LAMP試劑盒體系配制反應(yīng)體系，用LAMP RealTime Turbidimeter LA-320c對反應(yīng)進程進行實時監(jiān)控，根據(jù)陽性樣品的反應(yīng)時間、擴增速率、引物組的非特異性擴增等條件進行5組引物的篩選。反應(yīng)條件設(shè)定為62 ℃（根據(jù)Bst酶推薦的擴增溫度為60～65 ℃的特性確定）60 min。

1.2.3 LAMP反應(yīng)體系優(yōu)化方法 參照國內(nèi)外相關(guān)文獻[15-19]，初步確定25 μL的LAMP反應(yīng)體系，其成分包括：基礎(chǔ)反應(yīng)液12.5 μL，F(xiàn)3、B3（10 μmol/L）各0.5 μL，F(xiàn)IP、BIP（100 μmol/L）各0.5 μL，Bst DNA聚合酶1 μL，模板DNA 2 μL，滅菌雙蒸水7.5 μL。反應(yīng)條件為66 ℃ 60 min。基礎(chǔ)液反應(yīng)成分及濃度為：20 mmol/L Tris-HCl（pH=8.8，25 ℃），20 mmol/L KCl，20 mmol/L（NH4）2SO4，1% Tween-20，1.5 mol/L Betaine，2.5 mmol/L dNTPs，15 mmol/L MgSO4。

從鎂離子濃度、甜菜堿濃度、dNTPs濃度、引物濃度和反應(yīng)溫度5個變量參數(shù)進行單因素變化實驗，對 LAMP反應(yīng)體系進行優(yōu)化。

（1）鎂離子濃度優(yōu)化：設(shè)置鎂離子濃度梯度依次為12、14、16、18、20 mmol/L；

（2）甜菜堿濃度變化：甜菜堿的濃度分別設(shè)定為2.4、2.6、2.8、3.0、3.2 mol/L；

（3）dNTPs濃度優(yōu)化：dNTPs的濃度分別設(shè)定為2.2、2.4、2.6、2.8、3.0 mmol/L；

（4）引物濃度優(yōu)化：固定外引物F3、B3的用量（5 pmol）不變，設(shè)置內(nèi)引物FIP、BIP的用量以20、30、40、50、60 pmol依次遞增；

（5）反應(yīng)溫度優(yōu)化：將反應(yīng)溫度梯度設(shè)定為58、60、62、64、66、68 ℃；

利用LAMP Real Time Turbidimeter LA-320c對反應(yīng)進行實時監(jiān)控，收集擴增起始時間、最大擴增速率等信息進行顯著性分析。

1.2.4 特異性分析 分別以柑橘潰瘍病菌（X. axonopodis pv. citri）、柑橘黃龍病菌亞洲種（Ca. Liberobacter asiaticum）、野油菜黃單胞桿菌（X. campestris pv. campestris）、短小芽孢桿菌（B. pumilus）、短波單胞桿菌（B. segers）、鞘胺醇單胞菌（S. sp.）、成團泛菌（P. agglomerans）、嗜冷桿菌（P. sp.）、水稻細條病菌（X. oryzae pv. oryzicola）、蘇云金芽孢桿菌（B. thuringiensis）、枯草芽孢桿菌（B. subtilis）、蠟質(zhì)芽孢桿菌（B. cereus）、番茄細菌性潰瘍病菌（C. michiganensis）、大白菜軟腐病菌（E. carotovora subsp. carotovora）的DNA為模板，用篩選出的引物及溫度條件進行LAMP擴增，評價引物的特異性。

1.2.5 靈敏度分析 將提取的柑橘潰瘍病菌基因組DNA稀釋至 20 μg/mL，然后10倍梯度稀釋到10-7，采用以上優(yōu)化的體系進行LAMP擴增。同時按照SN/T 2622-2010《柑橘潰瘍病菌檢疫鑒定方法》[20]進行常規(guī)PCR擴增和熒光定量 PCR擴增，比較LAMP體系與PCR體系基因組DNA檢測的靈敏度。

1.2.6 穩(wěn)定性試驗 為評價該LAMP檢測體系的穩(wěn)定性，采用同一批提取的柑橘潰瘍病菌基因組DNA作為模板進行為期一周的穩(wěn)定性試驗，每天1次，每次3個重復(fù)，用LAMP Real Time Turbidimeter LA-320c收集開始擴增時間，計算變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）。

1.2.7 擴大試驗 分別采用LAMP方法、PCR方法、Real-Time PCR方法對212份柑橘葉片樣品進行實際檢測，比較符合率。所采集樣品包括疑似染病的柑橘葉片樣品和無染病癥狀的柑橘葉片樣品。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物篩選結(jié)果

實時擴增圖見圖1，5組引物中有ID1、ID3、ID5三組成功擴增目的片段，3次重復(fù)結(jié)果見表2所示，ID1引物組平均起始擴增時間為28.08 min，4 min內(nèi)即達到最大反應(yīng)速率，較其他引物組起始反應(yīng)時間短，擴增速率高，符合LAMP快速反應(yīng)的要求，初步確定為xac-LAMP檢測用引物。使用ID1號引物進行LAMP擴增后的產(chǎn)物測序后經(jīng)比對顯示，序列與X. axonopodis pv. citri的hypothetical protein基因序列相似度達100%，表明ID1號引物組擴增準確及特異。

2.2 LAMP的反應(yīng)體系優(yōu)化結(jié)果

根據(jù)LAMP Real Time Turbidimeter LA-320c對反應(yīng)進行實時監(jiān)控和信息分析得出最佳參數(shù)為：鎂離子濃度16 mmol/L；甜菜堿濃度2.8 mol/L；dNTPs濃度2.8 mmol/L；反應(yīng)溫度66 ℃。當外引物F3、B3的用量為5 pmol，內(nèi)引物FIP、BIP為50 pmol時，起始反應(yīng)時間最短，擴增效率最高，因此確定引物FIP、BIP、F3與B3的終濃度比為10 ∶ 10 ∶ 1 ∶ 1。根據(jù)上述數(shù)據(jù)，建立最佳反應(yīng)體系，見表3所示。

2.3 特異性試驗結(jié)果

用ID1引物組進行特異性試驗，實時擴增見圖2，結(jié)果顯示，僅有柑橘潰瘍病菌的 DNA產(chǎn)生擴增反應(yīng)，其余13種對照菌株均未產(chǎn)生擴增反應(yīng)，表明ID1引物組特異性良好，可以作為xac-LAMP特異性檢測的引物。

2.4 LAMP與PCR 方法檢測靈敏度的比較

所建立的xac-LAMP檢測方法分別與普通PCR方法、實時熒光定量 PCR方法進行了靈敏度比較試驗，結(jié)果見圖3和表4。

從結(jié)果可看出，PCR方法的DNA檢測下限為10-2，濃度為0.2 ng/μL，LAMP與熒光定量PCR方法的DNA檢測下限均可達10-3，可檢測到0.02 ng/μL的DNA。說明本研究所建立的LAMP方法靈敏度與熒光定量PCR方法相同，比常規(guī)PCR方法高1個數(shù)量級，顯示出良好的應(yīng)用前景。

2.5 穩(wěn)定性試驗結(jié)果

根據(jù)表5的統(tǒng)計結(jié)果，為期1周的穩(wěn)定性試驗結(jié)果良好，檢測結(jié)果之間的CV%小于5%，介于0.55%與2.21%之間，說明該LAMP檢測體系的穩(wěn)定性良好。

2.6 擴大試驗結(jié)果

采集212份柑橘葉片樣品作為試驗材料，樣品包括疑似染病的柑橘葉片樣品和無染病癥狀的柑橘葉片樣品。柑橘葉片樣品經(jīng)表面消毒后剪碎放入充分預(yù)冷的研缽中， 加入液氮迅速研磨至粉末狀，用promega wizard基因組DNA提取試劑盒提取樣品總DNA，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩０凑誼ac-LAMP檢測方法對提取的樣品總DNA進行檢測，每個樣品2次重復(fù)，統(tǒng)計陽性結(jié)果。結(jié)果用本研究建立的xac-LAMP檢測方法檢出陽性樣品73份，陰性樣品139份，用實時熒光定量PCR方法檢出陽性73份，陰性139份，用PCR方法檢出陽性56份，陰性樣品156份。由此可知，本研究建立的xac-LAMP檢測方法與熒光PCR方法的符合率為100%，與常規(guī)PCR方法的符合率為91.98%。

3 討論與結(jié)論

目前已有利用LAMP方法檢測柑橘潰瘍病菌的相關(guān)文獻報道。2010年，董歡[21]基于柑橘潰瘍病菌獨有的保守蛋白基因設(shè)計了LAMP特異性引物，并對該方法特異性和靈敏性進行了評估。2013年，張侖等[22]建立了柑橘潰瘍病菌的普通LAMP及快速LAMP檢測方法，還應(yīng)用環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)快速檢測柑橘潰瘍病菌進行研究[23]。本研究也是采用LAMP方法對柑橘潰瘍病菌進行檢測，但采用的LAMP技術(shù)不同。本研究通過濁度儀的精確設(shè)置排除了假陽性和非特異反應(yīng)，保證了檢測的準確性。而上述報道的研究仍停留于2000年初的LAMP檢測技術(shù)，LAMP檢測結(jié)果的判定采用的是凝膠電泳方法，耗時費力，因此不是真正的快速檢測技術(shù)。上述研究也沒有采用不開蓋技術(shù)，由于LAMP高溫反應(yīng)后產(chǎn)生的氣溶膠極易導(dǎo)致污染，因此假陽性率高。

在LAMP檢測技術(shù)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)上，已報道的柑橘潰瘍病菌的LAMP檢測技術(shù)與本研究也存在很多不同。首先，引物的設(shè)計與前述研究完全不同。本研究基于柑橘潰瘍病菌高度保守的蛋白序列（accession no.AE008923.1）設(shè)計LAMP引物，通過濁度圖、擴增效率和擴增曲線相互印證，篩選出擴增效率最佳的一組引物，保證了引物的高度特異。其次，在特異性實驗中提供的對照菌不同。本研究篩選的引物組對柑橘黃龍病菌亞洲種、短小芽孢桿菌、短波單胞桿菌等13種對照菌均未產(chǎn)生擴增反應(yīng)，表明LAMP引物組具有很高的特異性。董歡[21]的研究中僅提供了4種對照菌，對照菌數(shù)量太少，不能在假陽性和假陰性的排除上提供有說服力的證據(jù)。另外，在實際檢測中的穩(wěn)定性效果不同。本研究從鎂離子濃度、甜菜堿濃度、dNTPs濃度、引物濃度和反應(yīng)溫度5個變量參數(shù)對 LAMP檢測體系進行了優(yōu)化，保證了檢測體系的特異性、靈敏度和穩(wěn)定性。該檢測方法經(jīng)實際檢測，結(jié)果之間的變異系數(shù)CV%小于5%。而文獻[21-22]中沒有經(jīng)過大量樣本的實際檢測來驗證LAMP檢測體系的穩(wěn)定性，因此LAMP體系的實際檢測效果不明確。對靈敏度的檢測限進行比較，本研究基因組DNA最低檢測限可達0.02 ng/μL，靈敏度與熒光定量PCR方法相當，比PCR方法高1個數(shù)量級，顯示出了較高的應(yīng)用價值。田間實測試驗表明，本研究檢測結(jié)果與熒光定量 PCR符合率為100%，沒有出現(xiàn)漏檢。且實測試驗數(shù)據(jù)建立在染病柑橘葉片樣品總DNA的基礎(chǔ)上，靈敏度結(jié)果與實際情況更接近。該檢測靈敏度為張侖研究報道的普通IAMP檢測體系靈敏度的10倍。雖然張侖報道快速LAMP檢測體系的DNA檢測靈敏度可達2.03×10-5 ng/μL，但同時指出由于快速LAMP檢測體系污染率較高，實驗室對環(huán)境和操作要求極為嚴格，因此難以滿足田間大規(guī)模樣品普測的要求。在董歡[21]與張侖等[22]的研究中，實驗樣品均為純菌菌株DNA，而在實際檢測中提取的是總DNA，因此無法精確評估實驗的實際檢測靈敏度。

綜上所述，本研究建立的LAMP實時濁度法是一種全新的柑橘潰瘍病菌的LAMP檢測方法，國內(nèi)外未見相關(guān)報道。本研究還可利用鈣黃綠素、SYBR GREEN等染料對擴增產(chǎn)物進行顯色，通過反應(yīng)管最終的顏色變化肉眼觀察檢測結(jié)果，滿足可視化現(xiàn)場檢測的要求。該方法具有特異性強，靈敏度高，方便可靠，成本低的特點，作為柑橘的口岸檢疫和生產(chǎn)上的快速篩查手段，具有廣闊的應(yīng)用前景。

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