蒙藥暖宮七味丸微生物限度檢查方法的驗證

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【摘 要】 目的：應用驗證試驗，為暖宮七味丸制定微生物限度檢查法。方法：采用藥典規定的常規法和培養基稀釋法，低速離心+薄膜過濾法測定該藥品對5株驗證菌的回收率，同時驗證控制菌的檢驗方法。結果：5株人工污染菌的回收率均達到70%以上，符合驗證要求。結論：經驗證的方法有效去除了暖宮七味丸的抑菌成分，可用于該藥品的質量控制。

【關鍵詞】 暖宮七味丸；微生物限度檢查；驗證試驗

【中圖分類號】R29 【文獻標志碼】 A 【文章編號】1007-8517（2015）11-0003-02

暖宮七味丸是收載于《衛生部藥品標準》蒙藥分冊的口服丸劑。具有調經養血，暖宮，驅寒止痛之功效[1]。作用效果顯著，未見毒副作用，是一種臨床常用藥。由于暖宮七味丸含有多種抑菌成分，如果僅采用常規的微生物限度檢查方法，則不能反映出樣品被微生物污染的情況。為此須選擇合適的方法去除其抑菌成分，并對方法進行驗證。本文依照微生物限度檢查法的現行標準（《中國藥典》2010年版一部）的相關規定[2]，建立了暖宮七味丸的微生物限度檢查法；驗證結果證明檢驗方法簡便易行，準確可靠，為同類藥物的微生物限度檢查，提供了科學的試驗依據。

1 儀器與材料

1.1 儀器

1.2 供試品 暖宮七味丸 新疆巴州第二人民醫院提供。

1.3 培養基

1.4 試驗用菌株

以上菌株均為第三代，來自中國食品藥品檢定檢驗院。

2 方法與結果

2.1 菌液制備分 別取枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌（sau）、大腸埃希菌（ECO）標準菌株各適量，轉種于10ml滅菌后的營養肉湯中，于恒溫（37℃）下培養18～24h；取白色念珠菌（cal）適量，轉種于改良馬丁培養基中，在25℃下恒溫培養24～48h。分別移取1ml上述培養物，分別置于盛有加9ml的 0.9%無菌生理鹽水溶液的試管中，十倍稀釋使約為10-5～10-7（50～100cfu/ml）的菌懸液[2]。

將黑曲霉轉移在改良馬丁瓊脂培養基上，25～28℃培養7d，用5ml 0.9%無菌生理鹽水溶液洗脫孢子，之后移取1ml孢子液加入9ml 0.9%無菌生理鹽水溶液中，十倍稀釋使約為10-4～10-6（50～100cfu/ml）的孢子懸液[2]。

2.2 供試液制備取 樣品10g，置錐形瓶中，加無菌NaCl-蛋白胨緩沖液（pH7.0）至100ml，4000rpm/min振搖5min，使充分溶解分散均勻，便可（1∶10）。

2.3 細菌、霉菌及酵母菌檢查方法的驗證[2]

2.3.1 試驗組

2.3.1.1 平皿法 取“2.2”項下的供試液1ml，及“2.1”項下的5種驗證用菌液各1ml，分別注入平皿中，快速倒入45℃完全溶化的相應培養基20ml，為減少誤差每株菌平行制備2個平皿，待冷凝后，置所需溫度下倒扣培養至規定的時間，觀察計數。（結果見表1）

2.3.1.2 培養基稀釋法 取供試液（10-1）1ml，等量分注5個平皿（0.2ml/皿），同時加入枯草芽孢桿菌50～100cfu，于所需溫度下倒扣培養至規定的時間，觀察計數。（結果見表3）

2.3.1.3 低速離心+薄膜過濾法 取供試液（1∶10）10ml，置無菌離心管中，以500r/min離心10分鐘，分取上清液補加無菌NaCl-蛋白胨緩沖液（pH7.0）至10ml；過濾前用適量的稀釋液濕潤濾膜，之后將上述供試液10ml，用無菌NaCl-蛋白胨緩沖液（pH7.0）100ml稀釋后薄膜過濾，以無菌NaCl-蛋白胨緩沖液（pH7.0）沖洗濾膜，共4次，每次100ml，將1ml枯草芽孢桿菌倒入最后1次的沖洗液里，混勻，過濾，取出濾膜，將菌面朝上，貼在預先制備好的相應培養基平板上培養，觀察計數。（結果見表3）

2.3.2 菌液組 除了不加入供試液之外，其余按實驗組的方法測定所加入的試驗菌數。

2.3.3 供試品對照組 不加試驗菌之外，其余方法同試驗組，測定供試品本底菌數。

2.3.4 稀釋劑對照組 將無菌NaCl-蛋白胨緩沖液（pH7.0）10ml于離心管中，加枯草芽孢桿菌1ml，其余操作同低速離心+薄膜過濾法。

2.4控制菌檢查方法的驗證

2.4.1 大腸埃希菌 量取“2.2”項下的供試液（10-1）10ml，轉種于100ml的BL中，作為供試品組。另分別量取100ml的BL2瓶，每瓶中加入供試液（10-1）各10ml，其中1瓶中加入1ml ，81cfu/ml大腸埃希菌，為試驗組；另1瓶中加入金黃色葡萄球菌88cfu/ml，為陰性菌對照組。3個組均置于37℃下恒溫培養24h，觀察培養基澄清度的變化；之后分別取渾濁管中的增菌培養物0.2ml做熒光反應與靛基質試驗[2]。（結果見表4）

2.4.2 大腸菌群 取“2.2”項下10-1的供試液1ml，用0.9%無菌生理鹽水稀釋制成10-2和10-3的供試液。取10ml的乳糖膽鹽發酵培養基3管，分別接入10-1、10-2、10-3的供試液各1ml，之后每管加入1ml

81cfu/ml大腸埃希菌為試驗組。另取10ml的乳糖膽鹽發酵培養基3管，同試驗組的方法操作，其中加金黃色葡萄球菌（88cfu/ml）為陰性菌對照組；每管于恒溫（37℃）下培養24h，觀察結果[2]。（結果見表5）

3 討論

3.1 微生物限度檢查法為藥物安全性檢測的必檢項目之一。暖宮七味丸是由7種蒙藥材白豆蔻、天門冬、手掌參、沉香、肉豆蔻、黃精、丁香組成的口服丸劑，其中任一成分均有可能有不同程度的抑菌作用。根據其給藥途徑及處方分析，必須選用適當的方法處理供試品，以去除抑菌作用才能進行微生物限度檢查，否則無法準確檢出供試品中污染的微生物。

3.2 從表1結果可以看出，通過平皿法驗證可知，暖宮七味丸對白色念珠菌、黑曲霉、大腸埃希菌及金黃色葡萄球菌沒有抗菌作用或抗菌作用很弱，回收率在79%～100%之間，試驗結果得到令人滿意的效果（規定大于70%），為此平皿法可用于該藥品的霉菌及酵母菌數檢查。從表1還可以看出，暖宮七味丸對枯草芽孢桿菌非常敏感，完全被抑制，回收率僅為0；說明該藥品對細菌的生長繁殖有較強的抑制作用，不能采用平皿法測定細菌數；必須改用其它的方法消除對細菌的抑制作用；于是本試驗改用了培養基稀釋法和低速離心+薄膜過濾法；表3結果顯示，每皿0.2ml，消除抑菌成分仍達不到滿意的效果，回收率低于70%。為了得到準確、可靠的結果，細菌數的測定方法采用了低速離心+薄膜過濾法，結果基本排除了抑菌活性成分，回收率達到70%以上；由此可見，低速離心加薄膜過濾法用于暖宮七味丸的細菌數檢查，結果比較可靠。

3.3 本品含原藥材粉末，按規定須檢驗大腸埃希菌及大腸菌群。由表4、5可以看出，在控制菌的驗證中，試驗組判斷為陽性，結果檢出控制菌（大腸埃希菌）；陰性菌對照組實驗結果為陰性，金黃色葡萄球菌未被檢出；故控制菌（大腸埃希菌、大腸菌群）用常規方法檢驗。

依據方法驗證試驗，暖宮七味丸的微生物限度檢查可采用低速離心加薄膜過濾法檢驗細菌數；霉菌及酵母菌數選用平皿法檢驗，控制菌檢驗則選用常規法即可達到效果。

參考文獻

[1]衛生部藥典委員會.《衛生部藥品標準》蒙藥分冊[S].1998：192

[2]國家藥典委員會.《中國藥典》[S].一部.2010：附錄79-88.